Основываясь на постановлении униатского Собора, король признал законной только греко-католическую (униатскую) церковь, православную церковь объявил не подчинившейся «свободному» решению Собора, а потому не имеющей права на существование. Грамотой от 15 декабря 1596 г. Сигизмунд III объявил православным жителям Речи Посполитой о низложении епископов Гедеона (Балабана) и Михаила (Копыстенского) и о необходимости подчинения униатскому митрополиту Михаилу (Рогозе) и другим архиереям, принявшим унию. Униатские епископы были наделены широкими правами, доходными имениями и монастырями. Епископские кафедры могли быть заняты только униатами, братства были подчинены местным архиереям. Многие священники, чтобы не лишиться мест и средств к существованию, принимали унию и свои приходы обращали в униатские. Не уступавшие клирики изгонялись из храмов, подвергались истязаниям, и их места передавались униатам. Так же поступали с настоятелями монастырей и иноками. Первым православным, арестованным за участие в работе Собора и непризнание унии, стал экзарх Никифор, заточённый в Мариенбургский замок, из которого он так и не вышел. Затем начались преследования всех православных, с этого времени всё больше представителей знати в Речи Посполитой принимали католицизм, реже унию. Православие начало превращаться в религию низших сословий – «хлопскую» веру. На белорусских землях (в отличие от украинских) православие оказалось в особо трудном положении: там не было ни одного православного епископа. Сразу же после принятия Брестской унии началась полемика. Она была открыта почти одновременно опубликованными работами: Петра Скарги «Синод Берестейский и его защита» с апологией унии и содержащей критику решений унийного Собора «Эктезис, альбо Короткое собрание справ, которыя ся деяли на поместном Берестейском соборе». Против книги Петра Скарги был написан «Апокризис, альбо Отповедь на книжки о соборе Берестейском», автором которого являлся протестант Мартин Броневский (писавший под псевдонимом Христофор Филалет). Ответом на «Апокризис» со стороны греко-католиков стал «Антирризис», в котором Филалет обвинялся во лжи и клевете. Православные опубликовали «Перестрогу» (предостережение), где рассказывалось о причинах введения унии. В 1599 г. православные заключили союз с протестантами. Неприятие православным населением Брестской унии, казалось, могло похоронить её, так же как и Флорентийскую. Однако после кончины митрополита Михаила (Рогозы), не проявлявшего особой ревности в распространении унии, его преемник Ипатий Потей (1600–1613 гг.) начал активное наступление на православную церковь. Небольшая передышка наступила лишь в 1607 г., когда в конституцию Варшавского сейма была внесена особая статья «о религии греческой», в которой давалось обещание не нарушать прав русского народа в вере и не запрещать свободного отправления православных обрядов. Эта конституция явилась результатом настойчивых усилий, прилагавшихся православной шляхтой на сеймах в 1601–1607 гг., и тех политических событий, которые заставили правительство, преданное католицизму, сделать уступки православным.