Благодаря покровительству короля Стефана Батория (1574–1586 гг.) они утвердились в крупнейших городах Литвы и Западной Руси: Вильно, Орше, Несвиже, Витебске, Ковно, Гродно, Смоленске, Слониме, Двинске, Минске, Дрогичине, Мерече, Слуцке, Пинске и др. До конца XVI в. иезуиты основали восемь коллегий. Против православия («схизмы») иезуиты действовали, главным образом, с помощью устной и печатной полемики, проповеди и школы, куда охотно отдавали своих детей магнаты и шляхта. В 1579 г. при активной поддержке папского легата Антонио Поссевино в Вильно была открыта иезуитская академия, а при ней так называемая папская семинария, превратившиеся в мощный центр формирования католической идеологии. В 1582 г. на всех землях Речи Посполитой был введён григорианский календарь, в связи с чем были запрещены празднования по юлианскому календарю, а также торговля в дни католических праздников. Эта мера вызывала повсеместные волнения, особенно упорное сопротивление введению нового календаря оказали жители Полоцка. В сочинениях католических полемистов говорилось о том, что вывести православную церковь из кризиса может только уния с Римом. Важную роль в политике иезуитов в Великом княжестве Литовском играла деятельность учреждённых по их инициативе братств. Но главной победой иезуитов стало утверждение на польском королевском престоле их воспитанника Сигизмунда III (1587–1632 гг.), готового пойти на любые меры для насаждения католицизма. Реакцией на активное наступление на православие стало появление в конце XVI в. многочисленных православных сочинений, содержавших защиту своего вероучения и обличавших католичество. В Супрасльском монастыре были созданы «Послание до латин из их же книг» (1581 г.), «На богомерзкую, на поганую латину, которыи папежи, хто что в них вымыслили в их поганой вере, сказание о том», «Ключ царства небесного» Герасима Смотрицкого (1587 г.), направленные против сочинений Петра Скарги и Бенедикта Гербеста. На вечное изгнание королевской грамотой был осуждён Стефан Зизаний, напечатавший в 1596 г. в Вильно «Казанье св. Кирилла, Патриарха Иерусалимского, о антихристе и знаках его, с росширением науки против ересей розных». Однако это были инициативы, исходившие от отдельных кружков образованных людей и не находившие поддержки у иерархов. Борьба против православия, возведённая в ранг государственной политики, дискриминация православных, постоянное вмешательство польских королей во внутреннюю жизнь православной церкви привели к глубокому кризису западнорусской православной иерархии: православные кафедры часто оказывались в руках светских людей, покупавших их у короля и подолгу не принимавших епископского сана, или были заняты людьми недостойными, видевшими в своём высоком сане лишь источник обогащения. Примером архипастырей, мало заботившихся о нуждах церкви, исследователи называют Киевских митрополитов: Сильвестра (Белькевича; 1556–1567 гг.), Илию (Кучу; 1577–1579 гг.), Онисифора (Девочку; 1579–1589 гг.). Положение усугублялось и тем, что по мере распространения католицизма и Реформации многие магнаты и шляхта начали оставлять православие (во второй половине XVI в. приняли католичество многие представители знатных православных родов – из князей Острожских, Слуцких и др.), сменив веру, они присваивали себе имущество находившихся под их опекой церковных учреждений, вследствие чего во второй половине XVI в. перестали существовать многие православные обители, а другие пришли в упадок.