На территории Беларуси получили широкое распространение книги, издававшиеся на Украине (в частности, Острожская Библия). В XVI в. развернулась большая духовно-просветительская и храмоздательская работа таких известных поборников православия, как Иосиф и Иван Солтаны, Александр и Григорий Ходкевичи, князья Острожские, Олельковичи и др., в своих имениях создававших типографии, строивших храмы и монастыри. При Сигизмунде I на территории Великого княжества Литовского существовало свыше 80 православных монастырей и храмов, при Сигизмунде II – больше 95. В Вильно Сигизмунд I разрешил гетману Великого княжества Литовского Константину Ивановичу Острожскому перестроить Пречистенский собор, в котором в 1513 г. была погребена королева Елена Ивановна, а также Свято-Троицкую и Свято-Николаевскую церкви (1514 г.). При Сигизмунде I были основаны православные монастыри: в 1510 г. Сурдегский, около 1513 г. Браславский женский монастырь, около 1520 г. и позднее полоцкий Пятницкий, Тороканский (современная Гродненская область), пинский Варваринский женский монастырь и др. В 1517 г. между игуменами Троицкого слуцкого и киевского Николо-Пустынского монастырей был заключён договор о взаимном поминании братии (Вильнюс, Библиотека Академии Наук Литвы). В XVI в. построены церкви: Михайловская в Сынковичах, Рождества Богородицы в Мурованке (современная Гродненская область) и Благовещенский собор Супрасльского монастыря. В архитектурном оформлении православных храмов в XVI в. соединились традиции современной греческой архитектуры с чертами романского и готического стилей, исследователи отмечают, что главной особенностью каменных белорусских храмов того времени является обретение ими черт оборонных сооружений. В 1509 г. в Вильно состоялся Собор Западнорусской митрополии под председательством митрополита Иосифа II Солтана. На Соборе присутствовали семь архиереев, семь архимандритов, шесть игуменов, семь протопопов, священники. В определениях Собора говорилось о подборе кандидатов на поставление в священнический сан, об укреплении дисциплины среди духовенства, ограждении церкви от злоупотреблений светских патронов. Решения Виленского собора были подтверждены королевской грамотой на Брестском сейме 1511 г. В 1514 г. митрополит Иосиф созвал новый Собор в Вильно, на котором было определено 23 октября праздновать память преподобного Елисея Лавришевского. Ревнителями православия были также митрополиты, управлявшие Западнорусской митрополией после Иосифа II: Иосиф III (1522–1533 гг.), Макарий II (1534–1555 гг.) и Иона III (1568–1577 гг.), при которых митрополичья кафедра имела значительные земельные владения на территории Беларуси. Однако уже в это относительно благоприятное для православной церкви время в политике последних Ягеллонов складывалась тактика, которая постепенно привела западнорусскую православную иерархию к кризису. Это было вызвано особенностью положения православной церкви и православного общества на территории новообразованной митрополии в целом. Православная церковь Великого княжества Литовского была подчинена власти польского короля и великого князя литовского, католика по вероисповеданию, который имел право «опеки» над православными церковными учреждениями, назначал епископов и настоятелей монастырей.