В 1625 г., во время казацкого восстания Марка Жмайло, в Межигорском в честь Преображения Господня монастыре был захвачен и убит бывший киевский войт Фёдор Ходыка, скрывавшийся в обители и подозревавшийся в связях с униатами. В целом если в 1625 г. у братии монастыря были, скорее, враждебные отношения с казаками, то позднее, в 1630 гг., положение изменилось. В 1630 г., во время казацкого восстания Тараса Фёдоровича (Трясило), Межигорский в честь Преображения Господня монастырь успешно пережил осаду немецких наёмников. К этому году относится первое упоминание Межигорья как особого, «казачьего», монастыря. Во Львовской летописи под 1630 г. говорится, что немецкие наёмники разграбили Иорданский монастырь и подступили к Межигорскому монастырю, однако монахам удалось подготовиться к обороне. Шляхтич Симеон Окольский принимал участие в подавлении казацкого восстания Якова Острянина в 1638 г. и описал встречу казаков-повстанцев. Межигорский в честь Преображения Господня монастырь обеспечивал переправу для повстанцев и, как полагают исследователи, за определённую плату принимал на хранение от казаков награбленное имущество. Во время национально-освободительной войны Богдана Михайловича Хмельницкого Межигорский в честь Преображения Господня монастырь уцелел, но прилегающие угодья и сёла были разорены. Однако именно на вторую половину XVII в. приходятся основные земельные приобретения обители. 25 июня 1665 г., при игумене Иове (Станиславском), Межигорский в честь Преображения Господня монастырь сгорел. По Андрусовскому перемирию 1667 г. Межигорский в честь Преображения Господня монастырь отошёл Речи Посполитой. В связи с этим монастырь, например, должен был поддерживать дружеские отношения с гетманом правобережного казачества Остапом Гоголем, который в 1676 г. был поселён с казацким войском недалеко от Киева, в Дымерской волости. После подписания «Вечного мира» между Варшавой и Москвой в 1686 г. Киев и Межигорский в честь Преображения Господня монастырь окончательно вошли в состав Гетманщины и Московского царства. Со второй трети XVII в. Межигорский в честь Преображения Господня монастырь получал из Москвы значительную материальную поддержку. В Москву за милостыней регулярно ездили игумены Варнава (Лебедович), в 1647 г. получивший в российской столице книги и соболей на 100 руб., Иов (Станиславский) и особенно часто Феодосий (Васьковский). В начале 1655 г. в Межигорском в честь Преображения Господня монастыре игумен Варнава постриг в монашество Ивана Петровича Савёлова (впоследствии Иоаким, патриарх Московский и всея Руси). После пострига монах Иоаким служил келейником у «благоговейного старца» иеромонаха Маркиана. В апреле 1657 г. царь Алексей Михайлович послал в Межигорский в честь Преображения Господня монастырь через «старца» Иоакима 100 руб. До конца жизни патриарх Иоаким с благодарностью вспоминал о месте своего пострига, помогал Межигорскому в честь Преображения Господня монастырю во время строительства каменного Преображенского собора, присылал деньги, кровельное железо, иконописцев, а также жаловал церковную утварь и книги.