После его смерти 12 июля 1580 г. Межигорский в честь Преображения Господня монастырь получил в пожизненное владение Яким Высоцкий (владел до 1595 г.). О хозяйстве монастыря в XVI в. исследователям известно мало. Земельные угодья располагались непосредственно рядом с обителью, их границы были определены в привилее игумену Мисаилу (Щербине) и впоследствии неоднократно подтверждались польскими королями, украинскими гетманами и московскими царями. В описании Киевского замка 1552 г. сказано, что жители замкового села Петровцы Опанас Семибокович и Гаврило Малышкович дают на Межигорский в честь Преображения Господня монастырь по четыре и по два ведра мёда. В привилее 1571 г. упоминаются мельница близ монастыря, пасеки, «медовые дани», «бобровые гоны», рыбные озёра, виноградник и сады. В последние десятилетия XVI в. земельные угодья Межигорского в честь Преображения Господня монастыря подвергались нападениям местной шляхты и киевских мещан. В результате жалоб игумена Онуфрия Межигорский в честь Преображения Господня монастырь получил несколько королевских охранных привилеев и листов. В 1577 и 1580 гг. польский король Стефан Баторий выдал Межигорскому в честь Преображения Господня монастырю привилей на беспошлинный проезд через реку Днепр. В 1578 г. король писал чернобыльскому старосте Филону Семёновичу Кмите по поводу жалоб игумена Онуфрия о невыдаче медовой дани из сёл Толстый Лес и Сидоровичи за шесть лет. В 1580 г. король Стефан Баторий писал киевским мещанам о разрешении Межигорскому в честь Преображения Господня монастырю трижды в году «делать канун», «сытить и продавать мёд». В том же году король приказал киевскому ротмистру Касперу Стружчинскому защищать Межигорский в честь Преображения Господня монастырь от «мещанских обид». В 1580 г. игумен Онуфрий жаловался киевскому воеводе князю Константину Константиновичу Острожскому на притеснения со стороны подвоеводы Матеуша Воронецкого. Регулярными были невыплаты жителями сёл Вышгород и Петровцы медовой дани, пошлины за лов рыбы в монастырских озерах и рубку леса. В 1585 г. князь К.К. Острожский выдал охранную грамоту на монастырские земли, леса, озёра и виноградники от петровчан, вышгородцев и киевлян. Дважды, в 1589 и 1592 гг., киевский мещанин Ярмола Опалиха захватывал монастырскую ниву и озёра Заподь и Божатин. В 1592 г. Межигорский в честь Преображения Господня монастырь подвергся нападению казаков-повстанцев во главе с писарем Иваном Гренковичем, которые избили игумена Иосифа (Бобровича) и «пошарпали» королевские грамоты на земельные угодья. Исследователи полагают, что нападение было инспирировано жителями сёл Вышгород, Петровцы и Стрижов. В конце XVI в. князь К.К. Острожский выдал охранные листы Межигорскому в честь Преображения Господня монастырю, по его приказам начали уточнять границы земельных угодий и поставили во главе обители игуменов: в 1595 г. – Иосифа (Герасимовича), в 1599 г. – Афанасия (Московитянина; ум. в 1612 г.). Князь выдал им листы на игуменство, хотя предыдущие настоятели получали такие документы только от короля. В XVI в. монастырь не играл значительной роли в церковной жизни Киева.