Во время примирения епископа Гедеона (Балабана) и Львовского братства в начале июня 1595 г. архиерей дал запись Константину Константиновичу Острожскому с обязательством «мощне стать» против сторонников унии. На сейме, собравшемся в Варшаве весной 1596 г., Константин Константинович Острожский, выступая от православных дворян ряда воеводств Речи Посполитой, требовал, чтобы у епископов, отступивших от православия, были отобраны кафедры и переданы православным. Когда король отказался это сделать, православные дворяне – противники унии заявили, что не признают организаторов унии своими епископами и не позволяют им осуществлять свою власть на территории их владений. Антиуниатская деятельность Константина Константиновича Острожского стала причиной охлаждения к нему короля Сигизмунда III. Люди из окружения короля безосновательно обвинили тогда киевского воеводу в дестабилизации ситуации на украинских землях, в том числе путём поддержки казацкого восстания во главе с Северином Наливайко, бывшим слугой Острожских (брат Северина Дамиан служил православным священником в Остроге). В восстании Северина Наливайко (1595–1596 гг.) не использовались антиуниатские лозунги, казаки грабили имения шляхты и магнатов, не обращая внимания на вероисповедание владельцев, подверглись опустошению многие владения Острожских; на сейме в 1597 г. киевский воевода поблагодарил польного гетмана Короны Станислава Жолкевского за подавление восстания. Во второй половине 1595 г. Константин Константинович Острожский предпринял шаги к установлению сотрудничества между православными и протестантами для защиты религиозных свобод в Речи Посполитой. Летом того же года магнат обратился за содействием к главе протестантов в Великом княжестве Литовском Кшиштофу Радзивиллу. С этой целью он послал на совместный синод лютеран, кальвинистов и чешских братьев, проходивший в Торуне в августе 1595 г., шляхтича К. Лушковского, который привёз письмо князя с предложениями политического сотрудничества и религиозного сближения. Посланец Константина Константиновича Острожского выступал от православной шляхты Киевского, Волынского, Русского и Подольского воеводств. Константин Константинович Острожский предлагал протестантам совместную поддержку существенных для обеих сторон дел на сеймиках (а значит, и на сеймах) и посылку своих представителей на синоды, организуемые другой стороной. Предложение о сотрудничестве было принято. Большинство протестантов скептически отнеслись к возможности религиозного сближения с православными.