К началу XVI в. в монастыре появились постриженики из числа приближённых Волоцкого князя: дети боярские князь Андрей Голенин, князь Даниил (Лупа) Звенигородский, Нил (Полев), Андрей Невежа Квашнин, Павел Голова, Пётр Тютчев, Иона Голова Пушечников и др. В монастыре активно велось каменное строительство: в июне 1484 г. был заложен Успенский собор, освящённый в декабре 1485 г.; в 1495 г. на деньги князя Бориса Васильевича построена каменная церковь в честь иконы Божьей Матери «Одигитрия»; в мае 1506 г. на пожертвования князей Семёна Ивановича Бельского и Б.В. Кутузова сооружены тёплая церковь в честь Богоявления, кирпичная трапезная и хлебня. Жизнь в обители была организована в соответствии с требованиями написанного Иосифом монастырского Устава, в котором он обобщил всё лучшее из практики русских общежительных монастырей. В первоначальной, Краткой редакции Устава последовательно проводились принципы строгого монашеского общежития, полного равенства монахов и отказа от собственности. В Уставе изложены требования неукоснительного соблюдения монашеской дисциплины (посещения церковных служб, запрещения отлучек из монастыря, разговоров на трапезе и в кельях, обязательности послушаний). Сам Иосиф во всех монастырских службах подавал пример братии. В последние годы жизни Иосиф составил новую – Минейную редакцию Устава, из которой было исключено посвящённое проповеди личного нестяжания пятое Слово, а монахи с разрешения настоятеля могли покупать и продавать различные вещи. Принцип полного равенства монахов был заменён принципом «трёх устроений» соответственно силам и возможностям монашествующих; каждому «устроению» предписан свой порядок ношения одежды и приёма пищи. Управление монастырём первоначально осуществлялось преимущественно игуменом, который пользовался всей полнотой власти (в Уставе он именуется ктитором «киновиа Пречистыа богородица близ града Волока Ламьскаго»). Игуменом «своего ему монастыря» Иосиф назван и в адресованном ему полемическом «Ответе кирилловских старцев». С усложнением монастырского хозяйства возросла роль соборных старцев. В Послании великому князю Василию III Иосиф назвал имена десяти соборных старцев, которых считал достойными стать своими преемниками. Самым большим доверием игумена пользовались, как полагают исследователи, старцы Кассиан Босой и Иона Голова (Великие Минеи Четьи). Для совершения заупокойных богослужений в Волоколамском монастыре была разработана целая система правил. Иосиф обращал особое внимание на ведение синодиков: «...Всегда же в понеделник и въ среду понахида да поётся, в пяток же вечеръ болшаа понахида да бываеть; по заутреней же и по вечерни заупокойная литея да поётся». В Волоколамском монастыре впервые появляется разделение на повседневное поминание и синодик. Повседневное поминание совершалось священником на проскомидии, на анафоре во время Божественной литургии и на панихидах, а имена из синодика-помянника читались независимо от служб в течение дня. Внесение одного имени в повседневное поминание стоило 1 руб. на год или 50 руб. на поминание «в век». В синодик-помянник вносились имена всех вкладчиков, братии и трудников монастыря независимо от размера вклада или выполненной работы.