Царь Алексей Михайлович бывал на молебнах в соборе реже, а его преемники ни в Троицын день, ни в царские дни собор уже не посещали. В Великую пятницу в Благовещенском соборе совершался чин омовения святых мощей, хранившихся в храме. Чин начинался крестным ходом во главе с патриархом из Успенского собора в Благовещенский, где патриарх прикладывался к местным иконам, затем кадил разложенные на столе ковчеги, иконы, кресты и образки, в которые были вложены частицы святых мощей, прикладывался к каждой из реликвий. Затем крестный ход со всеми святынями возвращался в Успенский собор, где и совершался чин омовения, после чего с крестным ходом святых мощи возвращались в Благовещенский собор. В XVII в. в крестных ходах нередко принимали участие царственные особы. Этот чин совершался ежегодно вплоть до начала XX в. До 1520 гг. исследователям известны некоторые сведения о настоятелях-протопопах Благовещенского собора, однако о клириках не известно ничего. Со времени правления великого князя Василия III летописи и другие источники говорят о благовещенских протопопах как о духовниках великих князей. Среди кремлёвского духовенства протопопы-духовники занимали особое положение: ни одно из важнейших событий в жизни царя и его семьи не обходилось без их участия. Во время коронационных торжеств они переносили царские регалии из дворца в Успенский собор, протопоп шёл впереди царя с крестом и кропил путь святой водой. Духовники принимали участие в чине венчания, читали молитву над царицей на восьмой день после родов, нарекали имя новорождённому и, как правило, крестили царских детей. Духовники также участвовали в погребении членов царской фамилии. До середины XVI в. протопопы присутствовали на заседаниях Боярской думы. Первым из настоятелей Благовещенского собора, о котором исследователям известно, что он был царским духовником, является упомянутый в завещании Василия III 1523 г. протопоп Василий Кузьмич, человек богатый и влиятельный. О его исключительном положении при дворе великого князя свидетельствует тот факт, что среди душеприказчиков, упомянутых в его духовной, в полном составе значатся члены регентского совета, возникшего после смерти Василия III и состоявшего из дяди великой княгини Елены князя М.Л. Глинского, фаворита Василия III И.Ю. Шигоны Поджогина и боярина М.Ю. Захарьина. Из духовного окружения Ивана IV наиболее известен благовещенский священник Сильвестр, предполагаемый автор посланий, Жития равноапостольной княгини Ольги, Домостроя и один из деятельных членов «избранной рады» – группы царедворцев, приближённых к молодому царю и осуществлявших внутреннюю политику в России в 1550 гг. Протопоп Фёдор Бармин участвовал в январе 1547 г. в венчании Ивана IV царским венцом, нёс царские регалии, шёл впереди монарха с крестом и святой водой. Он был активным участником чрезвычайного заседания Боярской думы, состоявшегося после пожара 21 июня 1547 г. в Новинском монастыре у постели больного митрополита Макария. Его имя фигурирует среди имён влиятельнейших бояр, которые обвинили бабку Ивана IV княгиню А. Глинскую в колдовстве и поджоге столицы. Благовещенский протопоп Андрей сопровождал Ивана IV в походе на Казань, благословил его перед началом осады и решающим штурмом города, после взятия Казани участвовал в закладке и освящении первого православного храма в Казани – церкви в честь Благовещения Пресвятой Богородицы, служил благодарственный молебен по случаю покорения Казанского ханства. Впоследствии Андрей принял постриг с именем Афанасий и стал митрополитом Московским и всея Руси. Среди настоятелей Благовещенского собора были откровенные «ласкатели» грозного монарха, например, Евстафий, содействовавший низвержению Московского митрополита Филиппа (Колычева). Евстафий был непосредственным организатором разграбления архиерейского двора и храмов в Великом Новгороде во время похода на город в 1570 г. опричного войска.