Позднее, при великом князе Василии III Ивановиче, его соотнесли с памятью о чудесном избавлении Москвы от нашествия крымского хана Мухаммед-Гирея в 1521 г. В июле 1518 г. митрополит Московский и всея Руси Варлаам с крестным ходом, в котором участвовал прибывший в Москву с Афонской горы митрополит, встречал у монастыря принесённые из Владимира в Москву «для исправления живописи» древние иконы Спасителя и Божьей Матери и соборно служил им молебен в монастыре. В 1552 г. жители Москвы с крестным ходом вместе с митрополитом Московским и всея Руси Макарием и духовенством встречали «у Пречистые у Сретениа» войска, с победой возвращавшиеся из Казани. У стен обители царь снял с себя воинские доспехи, надел царскую одежду (шапку Мономаха, бармы и крест) и пошёл с крестным ходом в кремлёвский Успенский собор («Полное собрание русских летописей», том 13). В XVI в. была перестроена Мариинская церковь, о чём свидетельствовала датировка большемерных кирпичей, исследованных при её разборке в 1930 гг. В Смутное время, когда Московский Кремль захватили интервенты, в Московском Сретенском монастыре, по некоторым сведениям, располагался штаб русских ополченцев во главе с Козьмой Мининым и Дмитрием Михайловичем Пожарским (последнему в обители оказали первую помощь после тяжёлого ранения, полученного в марте 1611 г.). 2 мая 1613 г. в монастыре встречали избранного царя Михаила Фёдоровича Романова и его мать инокиню Марфу (Романову). Во главе духовенства был митрополит Ростовский и Ярославский Кирилл IV (Завидов). Вскоре игумен Сретенского монастыря Ефрем был послан царём «в польское сидение» за отцом царя митрополитом Филаретом (Романовым) и оставался с ним до возвращения в Московию в 1619 г. Впоследствии Патриарх Московский и всея Руси Филарет (Романов) часто служил в обители. При царе Михаиле Фёдоровиче в Московском Сретенском монастыре были возведены келейный и настоятельский корпуса. Московский Сретенский монастырь упоминается в 1620 гг. в связи с задонским в честь Рождества Пресвятой Богородицы монастырём, возможными основателями которого считаются сретенские старцы Кирилл и Герасим. Почитанию обители царской семьёй Романовых способствовало то обстоятельство, что монастырская церковь преподобной Марии Египетской единственная из московских была освящена во имя святой покровительницы супруги царя Алексея Михайловича Марии Ильиничны Милославской. Накануне их свадьбы (16 января 1648 г.) храм был отремонтирован. В 1651–1652 гг. царь Алексей Михайлович и Мария Ильинична вложили в монастырь для местного ряда иконостаса Сретенского собора общую икону своих небесных святых – преподобного Алексия, человека Божия, и преподобной Марии Египетской (ныне в Музее имени Андрея Рублёва). По инициативе царицы для этой церкви в 1668 г. был изготовлен так называемый Мариинский колокол (в настоящее время висит на среднем ярусе колокольни церкви во имя преподобного Иоанна Лествичника в Московском Кремле). С 1648 г. торжества 1 апреля, в день памяти преподобной Марии Египетской, в Московском Сретенском монастыре приобрело характер государственного праздника, на который торжественно приходили из Кремля царь и патриарх с митрополитами, собирались бояре и знать.