5 мая 1999 г. при монастыре в честь усекновения главы Иоанна Предтечи было учреждено Патриаршее подворье. 11 августа 2000 г. решением Синода монастырь в честь усекновения главы Иоанна Предтечи был открыт. В 2001 г. в Соборе Московских святых была прославлена блаженная Марфа. Летом 2001 г. ко дню праздника Рождества Иоанна Предтечи монастырский собор был передан обители. Патриаршим указом от 26 декабря 2001 г. настоятельницей монастыря в честь усекновения главы Иоанна Предтечи была назначена благочинная Пюхтицкого в честь Успения Пресвятой Богородицы женского монастыря монахиня Афанасия (Грошева), 11 сентября 2007 г. возведённая в сан игуменьи. 18 января 2002 г. обители были возвращены её главные святыни – древняя икона святого Иоанна Предтечи и чудотворный обруч, а также икона преподобной Елисаветы Чудотворицы. 19 января того же года в соборе была отслужена первая всенощная служба. 27 марта обитель впервые посетил Патриарх Московский Алексий II (Ридигер) и передал насельницам Черниговско-Гефсиманскую икону Божьей Матери. 11 сентября 2002 г. в монастыре в честь усекновения главы Иоанна Предтечи состоялась первая архиерейская служба, которую возглавил архиепископ Истринский Арсений (Епифанов), и отслужен молебен на ступенях монастырского собора. В 2003 г., в канун четвёртой недели Великого поста, в монастыре в честь усекновения главы Иоанна Предтечи состоялись первые постриги: в иночество были пострижены четыре сестры, стоявшие у истоков возрождения обители. 24 декабря 2004 г. Синод включил в Собор новомучеников и исповедников Российских протоиерея Алексия Петровича Скворцова (1875–1938 гг.), служившего в приходском храме бывшего монастыря. 6 октября 2006 г. канонизирован другой пастырь, служивший в монастыре в честь усекновения главы Иоанна Предтечи, – протоиерей священномученик Владимир Алексеевич Смирнов (1877–1937 гг.). Они были расстреляны на Бутовском полигоне. 11 сентября 2008 г. в подклете собора открылся монастырский музей истории обители. При восстановительных работах были обнаружены склеп благотворителей купцов Винокуровых и захоронение игуменьи Филареты (Ивановой; ум. 9 августа 1907 г.) с надгробным памятником. С 2012 г. при монастыре в честь усекновения главы Иоанна Предтечи действуют курсы дополнительного образования для насельниц женских монастырей, включённые в образовательную систему РПЦ, на которых преподаются Священное Писание Ветхого и Нового Заветов, история церкви, литургика, история церковного искусства, патрология, агиография и др. В подмосковном селе Остров в бывшей дворянской усадьбе устроены богадельня с домовым храмом в честь Покрова Пресвятой Богородицы и хозяйственное подворье. 14 декабря 2014 г. после длительной реставрации состоялось великое освящение собора в честь Усекновения главы святого Иоанна Предтечи и его бокового придела в честь Рождества Николая Чудотворца, которое совершил Патриарх Московский и всея Руси Кирилл (Гундяев). 11 сентября 2015 г. торжества, посвящённые 600-летию первого упоминания обители и 15-летию её возрождения, возглавил Патриарх Московский и всея Руси Кирилл (Гундяев).