Уцелевшие иконы из собора указывают на его обновление; на средства царя Ивана IV Васильевича были написаны как минимум Деисус, иконы Праздничного и Пророческого чинов иконостаса и храмовый образ святого Иоанна Предтечи. Монастырь не имел вотчин и поместий и содержался на государеву денежную и хлебную ругу. При царе Михаиле Фёдоровиче Романове в день Усекновения главы Иоанна Предтечи, 29 августа, к монастырю в честь усекновения главы Иоанна Предтечи совершались праздничные царские выходы. Судя по выдачам денег на молебны и к царским выходам, обитель была в числе наиболее почитаемых царицей Евдокией Лукьяновной монастырей и церквей Москвы. С монастырём в честь усекновения главы Иоанна Предтечи были связаны и близкие к царице лица, например, семья дворян Матюшкиных. В тот период около сотни стариц жили в монастыре на средства из казны. В монастыре в честь усекновения главы Иоанна Предтечи почиталась схимонахиня блаженная Марфа (ум. в 1638 г.), которая отличалась аскетичным образом жизни. Она была похоронена в северо-западном углу собора, а через два года после её смерти по царскому указу был выполнен покров на её гробницу (Центральный государственный исторический архив Москвы). За счёт казны к 1642 г. с запада к монастырскому собору пристроили трапезную с приделом во имя Николая Чудотворца (Книга расходная ладану 7151 (1642/1643) г. // Российский государственный архив древних актов). Тогда же, как полагают исследователи, возвели и каменную колокольню, на которую повесили колокол, отлитый по повелению царя Михаила Фёдоровича. Праздничные выходы в монастыре в честь усекновения главы Иоанна Предтечи совершались и при царе Алексее Михайловиче. После рождения в ночь с 26 на 27 августа 1666 г. наследника, будущего царя Ивана V Алексеевича, 29 августа царь Алексей Михайлович в монастыре в честь усекновения главы Иоанна Предтечи присутствовал на праздничной литургии и молебне и передал обители обновлённый царскими мастерами храмовый образ святого Иоанна Предтечи, небесного покровителя своего сына. Исследователи полагают, что выходы 29 августа к празднику в монастырь впоследствии стали регулярными. Представители многих княжеских и служилых московских семей делали вклады в монастырь в честь усекновения главы Иоанна Предтечи и хоронили в его некрополе своих близких. Судя по выпискам, вкладчиками монастыря были князья Лобановы, Туренины, Мордкины, Хилковы, Волконские, Хованские, Елецкие, Кропоткины, Голицыны, Лыковы, Татевы, Мезецкие, Барятинские, Бельские, Мещерские, Львовы, Трубецкие, а также семьи служилого дворянства – Дмитриевы, Измайловы, Загряжские, Кокошкины, Голенищевы, Кудашевы, Поздеевы, Аргамаковы, Стрешневы, Зюзины, Ржевские, Вышеславцовы, Сафоновы, Змеевы, Еропкины, Бутурлины, Волынские, Глебовы, Хотяевы, Бегичевы, Хитрово, Лызловы, Нарышкины, Хрущёвы. Представительницы этих семейств иногда принимали постриг в обители. В 1648/1649 г. настоятельницей монастыря в честь усекновения главы Иоанна Предтечи была игуменья Мария (Вышеславцова), родственники которой владели дворами, располагавшимися в непосредственной близости от обители. К известным родам принадлежали игуменьи Анна (Годунова; 1630 гг. – начало 1650 гг.), Евфимия (Вельяминова; 1654–1656 г.?), Евдокия (Философова; в 1661/1662 г.).