В 1292 г. генеральный капитул Ордена утвердил создание в кипрском Лимасоле центральной резиденции братства. В 1296 г. в городе был организован госпиталь по примеру Иерусалима и Акры. Госпитальеры намеревались отвоевать Святую землю, в защите которой они всё ещё видели свою главную задачу. В 1299–1300 гг. проходили переговоры с монгольским ильханом Газан-ханом (1295–1304 гг.), заинтересованным в союзе с Орденом в борьбе против египетских мамлюков. В июле 1300 г. король Кипра совместно с тамплиерами и госпитальерами направил из Фамагусты небольшой флот с войсками для атаки береговой линии мамлюков. Корабли подошли к Александрии, но затем двинулись на север, столкнувшись с вражеским флотом близ Акры и Тортозы (ныне Тартус, Сирия). Госпитальеры высадились возле Мараклеи и разорили город. Подошедшие войска мамлюков вынудили рыцарей отступить и спешно вернуться на галеры. В том же году в ходе следующей операции киприоты совместно с госпитальерами захватили Тортозу, но не смогли удержать город из-за отсутствия обещанной помощи со стороны монголов. Войска вскоре эвакуировались на контролируемый тамплиерами остров Руад (ныне Арвад, Сирия). В сентябре 1302 г. мамлюки захватили и этот форпост. Неудачная кампания продемонстрировала важность наличия сильного флота для успешного противостояния мамлюкам. В этот период происходит переориентация Ордена на морскую военную деятельность (в источниках под 1299 г. впервые упоминается об адмирале Ордена). В период пребывания госпитальеров на острове Кипр магистр Фульк де Вилларе (1305 – 1317/1319 гг.) принял судьбоносное для Ордена решение о завоевании острова Родос. В мае 1306 г. магистр встретился с неким генуэзцем Виньоло деи Виньоли, которому византийский император Андроник II Палеолог (1282–1328 гг.) якобы пожаловал острова Кос и Лерос и имение Лардос на Родосе. Виньоли договорился с магистром о совместном завоевании островов Додеканес и передал Ордену права на Кос и Лерос с получением взамен третьей части доходов от захваченных владений. Месяц спустя флотилия госпитальеров из двух галер и четырёх дополнительных кораблей с 35 братьями-рыцарями, некоторым количеством всадников и 500 пехотинцами на борту направилась из Лимасола на Родос. Попытка штурмом взять город Родос провалилась, началась изнурительная осада. В середине 1308 г. жители согласились сдать город госпитальерам; весь остров перешёл под контроль Ордена только к 1310 г. Разрешение папы Римского Климента V (1305–1314 гг.) на завоевание Родоса магистр Фульк де Вилларе получил в сентябре 1307 г., аргументировав действия Ордена тем, что Родос – необходимая база для последующего отвоевания крестоносцами Святой земли и Иерусалима. Однако после тяжёлого покорения Родоса Ордену пришлось сражаться с турецкими эмирами, пытавшимися в 1312, 1318 и 1319 гг. изгнать госпитальеров с острова. Рыцарям удалось успешно разбить все флотилии противника. Завоевание острова и создание на нём независимой территории госпитальеров проходили в сложный для духовно-рыцарских Орденов период. После утраты Святой земли в 1291 г. деятельность Орденов подвергалась критике, на них возлагалась ответственность за разгром христиан на Востоке. В 1307–1314 гг. французский король Филипп IV Красивый (1285–1314 гг.), руководствуясь мотивами, которые до настоящего времени остаются предметом споров, уничтожил Орден тамплиеров на территории Французского королевства.