При нём у Кирилловского Свято-Троицкого монастыря появились ктиторы-жертвователи: Анна Гулевичевна, бургомистр Денис Мартиянович и его семья, передавшие в обитель свои земли и дома в Киеве. Игумен Софроний смог проложить к обители дорогу по заболоченной местности, выстроить гати и соорудить мосты. Сбор пошлины за проезд торговых караванов по этим дорогам и мостам стал одним из важных источников пополнения монастырской казны. На «гетманский» период, когда светская и духовная власть в Киеве стала православной, приходится расцвет Кирилловского Свято-Троицкого монастыря; украинские гетманы считали своим долгом поддерживать древние православные святыни. Игумен Софроний умер между 1645 и 1648 гг., застав лишь начало этого процесса. После него кирилловскими наместниками были игумены-интеллектуалы, ректоры Киево-Могилянской коллегии: Иннокентий (Гизель; около 1650 – 1652 гг.), при котором монастырь был разорён вошедшими в Киев войсками коронного гетмана Януша Радзивилла; Лазарь (Баранович; 1652–1657 гг.), при нём Богдан Хмельницкий издал универсал (18 октября 1656 г.), подтверждавший все владения и права обители и защищавший её от магистрата; профессор поэтики и риторики Мелетий (Дзик; 1658–1677 гг.), на долю которого выпало много испытаний в период Руины. В 1662 г., когда татары из отрядов Юрия Богдановича Хмельницкого грабили киевские околицы, монастырь горел. В 1666 г. игумен Мелетий от имени духовных властей Киевской митрополии возил в Москву челобитную о возобновлении древнего права свободного избрания Киевского митрополита (Московский патриарх назначил местоблюстителем епископа Мефодия (Филимоновича), а Константинопольский – епископа Иосифа (Нелюбовича-Тукальского)); игумен Мелетий описывал тяжёлое состояние монастыря, пребывавшего «в облоге» со всех сторон (Архив Юго-Западной Руси, 1872 г., том 7). С именем игумена Мелетия связано и первое известие о чуде: игумен посылал к мощам великомученицы Варвары своего келейника Евстафия, который получил исцеление; в обители была учреждена практика братского чтения молитв и акафиста великомученице Варваре, установлено совершение крестных ходов к мощам святой в Михайловский Златоверхий монастырь. При игумене Мелетии ктиторами обители стали гетман Михаил Степанович Ханенко и его семья. Следующий игумен, Иннокентий (Монастырский; 1681–1697 гг.), поставил подпись под актом избрания в гетманы Ивана Степановича Мазепы (25 июля 1687 г.). Игумен пользовался его благосклонностью. Гетман выдал несколько универсалов с подтверждением старых и предоставлением новых владений Кирилловскому Свято-Троицкому монастырю (среди новых – богатые земли упразднённого ржищевского в честь Преображения Господня монастыря). Гетман принимал сторону обители во всех судебных спорах, ходатайствовал за неё, в частности, перед царём Петром I Алексеевичем. По сведениям комиссии, расследовавшей траты казны после смерти И.С. Мазепы в Бендерах, на Кирилловский Свято-Троицкий монастырь гетман выделил в общей сложности около 10 тыс. червонцев. Некоторые исследователи (Юрий Сергеевич Асеев) считают, что живопись (на клеевой основе) в соборе была создана во времена игуменства Иннокентия: Божья Матерь «Оранта» – в конхе центральной апсиды и Богородица, сидящая в беседке на фоне райского сада, – на северной стене нартекса, у входа на хоры (переписаны маслом в XIX в.); коронованная Богородица с Младенцем на коленях, Который правой рукой благословляет, а в левой держит сферу, – на северной стене нартекса, под хорами (этот образ в настоящее время не обнаружен).