По инициативе епископа Чигиринского Порфирия (Успенского), возглавлявшего Киевский Златоверхий монастырь в 1865–1877 гг., было построено деревянное на каменном фундаменте здание монастырской больницы. В 1890 гг. на месте северного Варваринского отделения был сооружён двухэтажный кирпичный корпус, в 1907–1908 гг. выстроена четырёхэтажная монастырская гостиница, которая по размерам считалась второй в городе после лаврской. К началу XX в. в обители находились также деревянная квасоварня, экономический двор с домом для эконома, его помощника и монастырских рабочих, с конюшней, амбарами, сараями, ледниками. По инициативе епископа Иеронима (Экземплярского) при Киевском Златоверхом монастыре открылись бесплатные школа церковного пения для подготовки псаломщиков и учителей пения и ежедневная читальня. Главной монастырской святыней были перенесённые из Константинополя мощи великомученицы Варвары. По мнению исследователей, на Русь они были привезены по просьбе одного из ближайших родственников князя Святополка Изяславича. О многочисленных исцелениях от святыни исследователям известно из повести, написанной в 1669–1670 гг. игуменом Феодосием (Сафоновичем). В 1644 г., при Киевском митрополите Петре (Могиле), к мощам совершил паломничество канцлер Польского королевства Георгий Осолинский, получивший в дар часть перста десницы великомученицы Варвары. Когда в 1650–1651 гг. Киев был захвачен литовским гетманом Янушем Радзивиллом, он также взял две частицы мощей святой. Одна частица находилась сначала у его жены Марии, дочери молдавского господаря Василия Лупу, затем хранилась в городе Каневе. По некоторым сведениям, при поддержке гетмана И.С. Мазепы в начале 1690 гг. частицу мощей перенесли в батуринский Крупицкий во имя святителя Николая монастырь, который возглавлял игумен Димитрий (Савич (Туптало)). Другая частица была передана Виленскому католическому епископу Георгию Тышкевичу. В 1701 г., следуя в Иерусалим через Киев, московский старообрядец Иоанн Лукьянов (Леонтий) так описывал визит в монастырь: «В Верхнем городе церковь хороша – Михайла Златоверхова; в той церкве мощи св. великомученицы Варвары; а меня грешного Бог сподобил ея мощи лобзати». Среди паломников к мощам были выходцы не только с Левобережной Украины, но и с Подляшья, Волыни, из Галиции, Подолии, Белоруссии, Литвы, России. Первоначально мощи великомученицы Варвары покоились в кипарисовом гробу, затем – в позолоченной раке из серебра, сделанной на средства гетмана И.С. Мазепы. По свидетельству архидиакона Павла Алеппского, рака стояла в соборе за левым клиросом. Над ней находилась сень с железной створчатой дверью. На средства статского советника Якова Алексеевича Шубского была поставлена новая деревянная резная позолоченная сень (1775 г.), «поддерживаемая четырьмя ангелами». В 1847 г. санкт-петербургский мастер Андреев на средства графини Анны Алексеевны Орловой-Чесменской изготовил новую позолоченную серебряную раку чеканной работы с сенью на четырёх серебряных «тумбах» с рельефными изображениями ангелов. Купол сени украшали позолоченные фигуры четырёх серафимов и четырёх херувимов. Над ракой висели девять лампад, одна из которых (золотая) пожертвована императорицей Екатериной II. Киевский митрополит Иоасаф (Кроковский) составил Акафист великомученице Варваре, который читался перед её мощами еженедельно по вторникам. В XIX в. существовала традиция 4 декабря торжественно обносить мощи вокруг собора. В 1930 гг. они были перенесены в Музейный городок в Киево-Печерском музее-заповеднике, в 1941–1944 гг. находились в Варваринских кельях обители, в 1944–1961 гг. – в Андреевской церкви. К 2013 г. святыня хранилась в киевском Владимирском соборе.