Таким образом, выдубицкие монахи не приняли унии и оставили монастырь. В постройках Киевского Выдубицкого монастыря разместилась официальная резиденция наместников Киевского униатского митрополита, а в кельях – женская община: в 1600 г. здесь проживало около десятка монахинь во главе с Устиньей. В 1605 г. монастырь вновь стал мужским, игуменом был Иоасаф (Быковский), ставленник униатского митрополита Ипатия Потея (Институт рукописей Национальной библиотеки Украины имени В.И. Вернадского). 22 января 1610 г. выдубицким настоятелем и наместником униатского митрополита в Киеве (Софии Киевской) стал Антоний (Грекович), прибывший в обитель 21 февраля. К тому времени алтарная стена Михайловского храма рухнула в Днепр. Игумен Антоний пристроил деревянную алтарную часть к обрушившемуся храму, оштукатурил и побелил её. К августу 1612 г. церковь уже действовала. Игумен-униат постоянно получал угрозы от казаков. Из его жалоб в суд видно, что в Киевском Выдубицком монастыре проживали лишь немногочисленные слуги самого Антония. 23 февраля 1618 г. запорожские казаки утопили Антония (Грековича) в Днепре рядом с монастырём, а саму обитель разграбили. Впоследствии униатскими игуменами были Исаакий (1618–1628 гг.) и Евстафий (Пешковский; 1628–1635 гг.). Немногочисленная братия жила за счёт переправы через Днепр, собственность на которую монастырю 24 августа 1628 г. подтвердил польский король Сигизмунд III с условием, что доходы будут использованы только на благоустройство подчинённой униатскому митрополиту обители. 15 июня 1629 г. по приказу печерского архимандрита Петра (Могилы) паром был сожжён, перевозчики избиты. В 1635 г. по требованию православных вместо Киевского Выдубицкого монастыря униатам был передан Борисоглебский монастырь. Киевский митрополит Пётр (Могила) совершил новое освящение обители и храма. В 1640 г. он обращался к царю Михаилу Фёдоровичу, прося средств на возобновление в камне алтарной стены собора (Архив Юго-Западной Руси, том 3). Сам митрополит Пётр (Могила) передал в Киевский Выдубицкий монастырь Служебник Печерской типографии (23 ноября 1636 г.), подписные серебряный потир и лжицу (13 января 1637 г., 11 января 1637 г.), Учительное Евангелие той же типографии (27 ноября 1637 г.), Евангелие львовской печати и напрестольный серебряный крест (26 и 27 мая 1642 г.). 19 августа 1645 г. королевский привилей на игуменство в Киевском Выдубицком монастыре получил Игнатий (Оксенович-Старушич), сподвижник митрополита Петра (Могилы). В 1646 г. игумен Игнатий испросил у царя Алексея Михайловича новые церковные сосуды, облачения, богослужебные книги, кадило: «Пожалуй, всесветлейший благочестивый царю, храм святаго архистратига Михаила оскудный в сосуды напрестольные, одежды священнические, книги церковные и кадилницу и что Бог на сердце положит Вашему царскому величеству» (Архив Юго-Западной Руси). Среди вкладов в обитель, поступивших при игумене Игнатии, – сохранившийся серебряный позолоченный потир с дарственной надписью 1648 г. В период его настоятельства Киевский Выдубицкий монастырь был разграблен войсками гетмана Яна Радзивилла. 12 июля 1650 г. игумен Игнатий был хиротонисан во епископа Могилёвского, Мстиславского и Оршанского. Вскоре после назначения умер; погребён в монастырском Михайловском храме. Сохранился текст его эпитафии.