В сентябре 1658 г. в городе Гадяче состоялось подписание договора между гетманом Иваном Евстафьевичем Выговским и представителями польского короля Яна II Казимира, предполагавшего создание федерации трёх равноправных государств: Польши, Литвы и «Великого княжества Русского» (в его состав должны были войти земли Киевского, Черниговского и Брацлавского воеводств). В Гадячском договоре шла речь и о предоставлении Киево-Могилянской коллегии статуса академии, а также «преррогатив и вольностей», аналогичных имевшимся у Краковской академии (состав учебного курса в коллегии специально не оговаривался). Предполагалось также, что все школы, созданные иезуитами, будут закрыты и перенесены за пределы указанных воеводств. Однако положения указанного договора не были воплощены в жизнь, поэтому коллегия не получила возможности реализовать на практике новый (по сути, университетский) статус. Вхождение И.Е. Выговского в союз с Польшей вызвало военное столкновение с Москвой. В 1659 г., во время боевых действий в Киеве, здания Братского монастыря были практически уничтожены, и Киево-Могилянская коллегия закрылась на несколько лет. Работу школы удалось восстановить лишь в 1662 г. Однако уже в 1665 г. Киев пережил очередное разорение. Ректор игумен Иоанникий (Галятовский), по собственному признанию, три года был вынужден скитаться по Волыни и Литве, не имея своей обители. Всё это привело к полному упадку школы. Положение коллегии осложнялось ещё и непростыми взаимоотношениями между Киевской митрополией и московским правительством. Несмотря на заключение Переяславского договора (1654 г.), Киевская митрополия осталась в каноническом ведении Константинопольского патриарха. Митрополит Сильвестр (Косов) противился попыткам перевести митрополию из константинопольской юрисдикции в московскую. И хотя в 1659 г. царь Алексей Михайлович специальной грамотой подтвердил все права Киево-Могилянской коллегии, в 1666 г. в ответ на просьбу гетмана Ивана Мартыновича Брюховецкого помочь обновить школу после её разорения московское правительство решило упразднить коллегию. От закрытия школу спасло заступничество киевского воеводы Петра Васильевича Шереметева Большого. Царь Фёдор Алексеевич, воспитанник иеромонаха Симеона (Полоцкого), стал покровительствовать Киево-Могилянской коллегии. Так, в 1681 г. он позволил инокам Братского монастыря раз в три года приезжать в Москву для сбора средств на содержание обители и школы. Вместе с тем Киево-Могилянская коллегия, расположенная в городе, государственная принадлежность которого в условиях военного противостояния могла вновь измениться, стремилась не утратить поддержку и властей Речи Посполитой. В частности, в 1670 г. ректору игумену Варлааму (Ясинскому) удалось добиться того, что польский король Михаил Корибут Вишневецкий издал привилеи, защищавшие имения Братского монастыря, расположенные на территории Речи Посполитой, и разрешавшие использовать доходы от них на восстановление коллегии, разорённой в годы военных действий. После 1650 г. ректорами Киево-Могилянской коллегии были игумены Лазарь (Баранович, 1650–1657 гг.), Мелетий (Дзик, 1657 г.), Иосиф (Мещеринов, 1657 г.), Иоанникий (Галятовский, 1657–1665 гг.), Варлаам (Ясинский, 1665–1673 гг.), Сильвестр (Головчич, 1673–1683 гг.), Иезекииль (Филиппович, 1684–1685 гг.).