Исаия входил в круг единомышленников архимандрита Елисея (Плетенецкого), что может служить косвенным подтверждением причастности последнего к созданию школы. Вскоре после открытия школы было создано и Киевское братство. Наиболее ранний список его членов датирован 4 января 1616 г. Оригинальные документы 1615–1616 гг., связанные с основанием школы и братства, не сохранились, поэтому в современной украинской историографии высказывались сомнения в достоверности гипотезы о создании школы именно в это время (подробнее см. в ст. Киево-Братский в честь Богоявления мужской монастырь). Тем не менее, основание Киевского братства в эти годы подтверждается другими источниками. Например, митрополит Иосиф Вельямин Рутский в проекте введения в Киеве унии (около 1618 – 1619 гг.) указывал, что большой преградой этим планам стало «новое братство, начатое схизматиками (т.е. православными) в Киеве тремя годами ранее без привилея его мосьци короля». Об учебной программе Киевской школы в первые годы её существования сохранились лишь отрывочные сведения. Исследователи полагают, что здесь преподавали грамматику, основы православного вероучения, славянский, польский, греческий и латинский языки и основы риторики. Школа была всесословной. В неё принимались как дети духовенства, так и шляхтичи, мещане и казаки. Значительному укреплению Братской школы способствовала материальная поддержка и покровительство гетмана Петра Кононовича Конашевича-Сагайдачного, который не позднее 1620 г. вместе со всем Войском Запорожским вступил в члены Киевского братства. Весной 1620 г. Иерусалимский патриарх Феофан IV, восстановивший православную иерархию в Киевской митрополии, проживал в Братском монастыре, где посещал новопостроенный (видимо, деревянный) монастырский храм, побывал в школе и странноприимном доме. До своей смерти (1622 г.) гетман П.К. Конашевич-Сагайдачный был главным жертвователем братства. Из текстов стихотворений, составленных ректором Братской школы Кассианом (Каллистом) Саковичем на погребение П.К. Конашевича-Сагайдачного, исследователям известны имена 20 учеников школы. Это была, как полагают исследователи, первая одновременная фиксация воспитанников школы. Смерть главного покровителя братства осложнила материальное положение как монастыря, так и школы. Митрополит Иов (Борецкий) принимал меры к тому, чтобы получить официальное разрешение властей Речи Посполитой на деятельность Братской школы в Киеве. Соответствующие прошения неоднократно отправлялись в Варшаву. 19 февраля 1629 г. король Сигизмунд III санкционировал своей грамотой деятельность Киевского братства. Однако упоминаний о Братской школе в Киеве эта грамота не содержала. В 1620 гг. Киевская школа становится лидирующим православным училищем в Речи Посполитой. В ней преподают некоторые учителя из Львовской Братской школы и других учебных заведений. Исследователи полагают, что среди преподавателей школы в это время были и греки. Так, 3 июня 1620 г. Александрийский патриарх Кирилл I Лукарис издал грамоту о назначении афонского постриженика иеромонаха Иосифа своим протосинкеллом и приказал ему прибыть «для науки и утверженья веры в Киев, и в Галич, и на Лвов, и на всю Белую Русь».