Незадолго до прихода Иова в Почаевский монастырь в обители, основанной в 1597 г., был принят общежительный устав, в 1597–1617 гг. в монастырь была перенесена чудотворная Почаевская икона Божьей Матери. Иов прибыл на Почаевскую гору в качестве простого инока, но и здесь прославился аскетическими подвигами, и братия между 1617 и 1623 гг. избрала его игуменом. Иов стал пятым настоятелем Почаевского монастыря. Он любил уединяться для молитвы в глубокую пещеру в Почаевской горе, где проводил по несколько суток. В 1641 г. Иов поставил на уступе скалы, вдавшемся в пещеру, список чудотворной Почаевской иконы Божьей Матери. Однажды, когда святой молился в пещере, её озарил необычный свет, сохранявшийся больше двух часов. Свидетелем чудесного явления был также ученик святого Досифей, описавший чудо в Житии Иова. Под схимнической одеждой преподобный носил власяницу и вериги. Вследствие «плоти измождения» тело Иова отделялось от костей, «о чём и до сего дне, – замечает Досифей, – свидетельствуют честныя мощи нетленныя, в раке лежащия». С братией настоятель обходился кротко и ласково. Иову приходилось совмещать аскетические подвиги с обязанностями игумена. На время его управления Почаевским монастырём пришёлся острый и продолжительный конфликт обители с белзским каштеляном протестантом А.А. Фирлеем, наследником скончавшейся в 1617 г. фундаторши Почаевского монастыря Анны Гойской, ставшим владельцем Почаева, Козина, села Орля и других селений. А.А. Фирлей отказался выполнять условия завещания Анны Гойской, внесённого 21 марта 1617 г. в кременецкие гродские книги, в котором ему предписывалось помогать Почаевскому монастырю и православной приходской церкви в селе Орля. А.А. Фирлей отнял у обители часть имений, пожертвованных ей в 1597 г. Выступая против почитания чудотворной иконы Божьей Матери и отпечатка стопы Пресвятой Девы на Почаевской горе, А.А. Фирлей задумал разрушить монастырь. Он запретил братии, не имевшей колодца, брать воду в соседнем селе Старый Почаев. Тогда Иов, помолившись Пресвятой Богородице, велел рыть колодец в горе, и на большой глубине была обнаружена вода, что было несомненным чудом, поскольку местность вокруг Почаева бедна водой. По приказу А.А. Фирлея урядник Г. Козинский с вооружённым отрядом 12 июля 1623 г. напал на Почаевский монастырь, захватил монастырскую церковь, похитил чудотворный образ Божьей Матери, богослужебные сосуды, облачения, драгоценные украшения икон. Награбленное было отвезено в родовой замок А.А. Фирлея в местность Козин. В документах отмечается, что нападение произошло при игумене Иове, – это первое упоминание об Иове как о настоятеле Почаевского монастыря. В последующие годы А.А. Фирлей захватывал монастырских крестьян, нападал на иноков, отнимал монастырские угодья. По мнению священника В. Левицкого, притеснения со стороны А.А. Фирлея пробудили у Иова мысль о переселении из Польско-Литовского государства в Москву. Такая мысль прослеживается в письме Иова царю Михаилу Фёдоровичу, написанном 1 мая 1626 г. и посланном через инока Почаевского монастыря Игнатия. Иов пишет, что он хотел бы лично поклониться царю – покровителю православных.