Около 1513/1514 г. в записи на Евангелии инок Нил (Полев) именует Даниила игуменом и духовным отцом (Российская государственная библиотека). По сообщению анонимного Жития, Иосиф оставил свои заповеди братии во главе с игуменом Даниилом. Исследователи полагают, что Даниил был священником и духовником братии и, согласно Уставу, с 1511/1512 г. ведал духовными делами, в то время как хозяйственную и другую деятельность в период болезни Иосифа контролировали келарь, казначей и соборные старцы. Число насельников Иосифова Волоколамского монастыря на протяжении XVI в. колебалось от нескольких десятков до 150. Поскольку в 1568/1569 – 1570/1571 гг. скончалось 300 монахов, количество насельников в первую половину XVI в. превышало сто. В 1578/1579 г. было 130 насельников, в 1598/1599 г. – 97, в 1601 г. – 140, в 1603/1604 г. – 110 монахов. Среди соборных старцев ведущую роль играли выходцы из вотчинников среднего достатка Волоцкого и соседних уездов. В XVI в. это были представители семей Ленковых (Герасим, Тихон, Феогност, Гурий (Руготин)), Полевых (Нил, Серапион, Симеон, Филофей, Герман), Ступишиных (Алексий, Трифон), Коровиных-Кутузовых (Иоасаф, Вассиан, Пафнутий), Мечёвых (Иов, Макарий), Толбузиных (Леонид), Плещеевых (Арсений, Феодосий), Ржевских (Арсений, Макарий, Тихон, Феодорит), Пушкиных (Вассиан, Феодосий), Ельчаниновых (Герман), Садыковых (Пимен), Ростопчиных (Зосима, Макарий). В первой половине XVI в. заметное место в управлении Иосифовом Волоколамским монастырём занимали члены семьи Ленковых. Герасим (Ленков) в 1517–1559 гг. был соборным старцем, в 1522 г. возглавлял монастырь, в 1532 г. был казначеем, участвовал в нескольких Соборах, в 1553 г. вёл следствие по делу Матвея Семёновича Башкина, в 1555 г. сопровождал на кафедру первого Казанского архиепископа св. Гурия. Феогност (Ленков) служил в 1531/1532 – 1563/1564 гг. соборным старцем, в 1531–1532 гг. вместе с Тихоном и Лукой (Ленковыми) надзирал за сосланным в обитель Вассианом (Патрикеевым), в 1534/1535 г. был казначеем. В 1525–1531 гг. Феогносту (Ленкову) был поручен надзор за Максимом Греком. Со времени основания в Иосифов Волоколамский монастырь переходили игумены и архимандриты из других монастырей (игумены из Саввина Сторожевского монастыря Иоасаф и Каллист, архимандрит Кассиан из Симонова монастыря, архимандрит Вассиан из тверского Вотмицкого монастыря). Многие представители духовенства принимали постриг в Иосифовом Волоколамском монастыре, в том числе дьяконы Вавила и Левкий Акишев, протопоп Симон Благовещенский, священник Андрей Симонов, архангельский ключарь Дионисий Фёдоров. В 1590–1596 гг. в Иосифовом Волоколамском монастыре проживал старец Мисаил Безнин, ранее бывший думным дворянином при царе Иване IV.