Первым архиепископом в завоёванную Казань 3 февраля 1555 г. был назначен бывший игумен обители Гурий (Руготин). Помощь архиепископу Гурию оказали старец Герман (Ленков) и Герман (Полев), ставший архимандритом в монастыре в Свияжске. Преемниками Гурия из числа пострижеников монастыря на Казанской кафедре стали: в 1564 г. – архиепископ Герман (Полев), затем – архиепископ Лаврентий, в 1575 г. – архиепископ Тихон (Хворостинин), в 1576 г. – архиепископ Иеремия, при котором состоялось чудесное обретение Казанской иконы Божьей Матери. В Полоцком походе 1563 г. царя Ивана IV сопровождал волоцкий игумен Леонид. После победоносного возвращения из похода у стен Иосифова Волоколамского монастыря царя встречал его сын царевич Иван. В 1563 г. постриженик Иосифова Волоколамского монастыря архиепископ Трифон (Ступишин) возглавил Полоцкую епархию. В Иосифовом Волоколамском монастыре были царские покои. 18 сентября 1573 г., когда в Иосифовом Волоколамском монастыре сгорело 17 келий, царь Иван IV остановился в обители по дороге из Новгорода и пожертвовал «200 рублев на кельи, а 50 рублев на масло» (Исторический музей). Волоцкие игумены регулярно посещали царскую резиденцию в Александровской слободе и походные станы Ивана IV. По свидетельству Евфимия (Туркова), занять пост игумена его уговорил царь Иван IV (Российская государственная библиотека). 17 декабря 1579 г., накануне Собора, на котором предполагалась отмена тарханов, игумен Евфимий был вызван в царскую резиденцию – Старицу. 20 декабря, после беседы с ним, царь Иван IV посетил монастырь и пожертвовал 164 руб. Игумен Евфимий принял участие в работе Собора и оставался в Москве до марта 1580 г. Во второй половине XVI в. сравнительно недавно основанный монастырь занял высокое, 19-е место в «Лествице духовных властей» (Российская государственная библиотека). Но его влияние в XVI в. не уступало Троице-Сергиевой лавре и Кириллову Белозерскому монастырю. Настоятели Иосифова Волоколамского монастыря становились участниками важнейших церковных Соборов и Земских соборов: в 1566 г. игумен Лаврентий был в числе духовных лиц, подписавших соборный приговор о продолжении войны с Литвой, в 1571 г. игумен Леонид (Протасьев) – в числе поручителей за князя Ивана Фёдоровича Мстиславского, в 1580 г. игумен Евфимий (Турков) подписал приговор Собора, игумен Левкий (Акишев) – приговор Собора 1589 г. Соборную грамоту об избрании Бориса Годунова на царство подписал игумен Геласий, грамоту об избрании на царство Михаила Романова – игумен Арсений (Собрание государственных грамот и договоров). Со времени Собора, осудившего жидовствующих (1504 г.), Иосифов Волоколамский монастырь использовался как место содержания лиц, изобличённых в ереси, несмотря на то что против этой практики решительно возражал Иосиф.