В росписи Благовещенского собора Московского Кремля середины XVI в. они представлены на южной грани северо-западного столпа, т.е. слева от центрального прохода и вблизи «царского места»; напротив, на грани южного столпа, изображены воины-великомученики Георгий и Димитрий Солунский. В Спасо-Преображенском соборе Ярославля (1563 г.) Борис и Глеб представлены на западных гранях западной пары столпов наоса, их образы встречают входящего в собор. Различные варианты изображения святых, часто с включением византийских императоров и Бориса и Глеба, представлены в росписях Архангельского собора Московского Кремля (восходит к 1565 г.), Смоленского собора Новодевичьего монастыря (1598 г.), церкви Святой Троицы в Вязёмах (около 1600 г.), Благовещенского собора Сольвычегодска (1601 г.), Рождественского собора в Суздале (восходит к 1636 г.), Успенского собора Московского Кремля (1642–1643 гг.), Ризоположенской церкви Московского Кремля (1644 г.), Успенского собора Княгинина монастыря во Владимире (1647–1648 гг.), Троицкого собора Ипатьевского монастыря в Костроме (1684 г.), Софийского собора в Вологде (1686–1688 гг.), Спасо-Преображенского собора Спасо-Евфимиева монастыря в Суздале (1689 г.) и др. В бесстолпных храмах образы Бориса и Глеба стали располагаться в верхних зонах росписей. Например, в Троицкой (ныне Покровской) церкви Александровой слободы (1571 г.), в медальонах на восточных гранях шатра, в церкви Воскресения в Ростове (1670 гг.), в откосах окон верхнего яруса наряду с князем Владимиром и императором Константином. В иконах и в прикладном искусстве изображения Бориса и Глеба (с князем Владимиром и без него) часто соотносятся с темой св. Креста и с образами святых Константина и Елены. Так, на «Киликиевском» кресте (конец XV в.) резная костяная пластина с фигурами святых Константина и Елены по сторонам креста корреспондируется с пластиной, где Борис и Глеб поднимают мученический крест. На иконе «Воздвижение креста» (XVI в.) по сторонам креста изображены Константин и Елена, а ниже, строго под ними, в ряду избранных святых, – Борис и Глеб. С темой св. Креста, Христова воинства и Небесного Иерусалима образы Бориса и Глеба связаны на иконе «Благословенно воинство Небесного Царя…» (середина XVI в.) из Успенского собора Московского Кремля. В центре, в окружении пеших воинов, изображён царь Константин на коне, с крестом, движущийся к Небесному Иерусалиму за архангелом Михаилом и Иисусом Навином(?), вслед за ними другие святые воины во главе с князьями Владимиром, Борисом и Глебом на конях. Начиная с XVI в. значение образов Бориса и Глеба именно как русских в сонме христианской святости подчёркивается включением их изображений в развивавшиеся в тот период многофигурные композиции, главным образом, посвящённые прославлению Богородицы. Например, иконы «О тебе радуется» (первой трети XVI в.) из Успенского собора в Дмитрове (в группе мучеников справа вверху с Владимиром), Покрова Богородицы (новгородская 1540 гг.) из собрания Н.П. Лихачёва (в группе мучеников слева вверху с Владимиром). Борис и Глеб входят в состав иконографических изводов, возникших в период позднего Средневековья. Этот извод представлен иконами, которые связаны с семьёй боярина, затем царя Бориса Фёдоровича Годунова (1587–1605 гг.), где изображены святые покровители самого Бориса и членов его семьи. Как правило, это Борис и в пару к нему Глеб, мученик Феодот Анкирский (Киринейский), покровитель второго имени царя (Богдан – греч. Феодот), великомученик Феодор Стратилат (святой сына), равноапостольная Мария Магдалина (святая жены), преподобная Ксения Римляныня (святая дочери). Эти святые представлены двумя симметричными группами, например, на иконах Прокопия Чирина рубежа XVI–XVII вв.