В Благовещенском соборе практически полностью сохранился уникальный ансамбль фресковой росписи середины XVI в. В конце XIX в. В.Д. Фартусовым и Н.М. Сафоновым была проведена антикварная реставрация стенописи. Было признано, что сохранность красочного слоя отличается неоднородностью; иногда он утрачен почти полностью, но система росписи, обладающая рядом уникальных черт, уцелела. До начала 1980 гг. стенопись датировали, согласно летописной записи 1508 г., и приписывали их кисти сыновей мастера Дионисия – Феодосия и Владимира, а росписи галерей – 1560 гг. После полного раскрытия живописи в 1980–1984 гг. у исследователей появилась возможность более тщательного изучения иконографии и стиля. Они высказали предположение об одновременной росписи собора и галерей в 1547–1551 гг. после московского пожара 1547 г. Часть северной паперти была расписана заново при её ремонте в 1564 г., южная – впервые украшена росписью в 1836 г., когда в ней был устроен Никольский придел. Благовещенский собор каждый раз украшался фресками, когда трижды перестраивался. Первая роспись, известная исследователям по письменным источникам (Троицкая летопись начала XV в.), была создана в 1405 г. Феофаном Греком, Андреем Рублёвым и Прохором с Городца. Монах Епифаний в своём письме Кириллу Тверскому (как полагают исследователи, игумену Спасо-Афанасиевского монастыря в Твери) указывает, что Феофан Грек включил в программу росписи Апокалипсис (первое упоминание об иллюстрировании Откровения Иоанна Богослова в православной традиции) и «Древо Иессеево» (впервые в России). Эти композиции сохранили центральное место в росписи существующего храма после исполнения новой живописи, что свидетельствует об их значимости. От фресок собора, упоминаемого в летописи под 1416 г., дошёл единственный фрагмент, позволяющий отнести его к кругу Андрея Рублёва. Роспись Благовещенского собора отличается «многословностью», насыщенностью циклами и отдельными сюжетами. При этом для каждой композиции характерны усложнённость, введение дополнительных эпизодов и персонажей, стремление наиболее подробно иллюстрировать текст. Многие композиции являются уникальными в русской монументальной живописи. Так, в скуфье центральной главы помещено погрудное изображение Вседержителя. Ниже – восемь архангелов. Между окнами – праматерь Ева, праотцы Адам, Авель, Ной, Енох, Сиф, Мелхиседек и Иаков (все в рост). В основании – 12 медальонов с изображением сыновей Иакова – «Колен Израиля». В северо-восточной главе – «Богоматерь Знамение», ниже – полуфигуры пророков с развёрнутыми свитками. Основой для этой композиции, возможно, послужила «Похвала Богоматери». Скуфью юго-восточной главы занимает изображение Саваофа (одно из наиболее ранних в русской живописи) в окружении херувимов. В парусах центральной главы написаны евангелисты, на подпружных арках – пророки в рост (считается работой иконописцев из Пскова). Нетрадиционно изображение пророка Моисея с пышными волосами и короткой бородкой, облачённого в царские одежды, с чашей в руках. Праздники написаны на сводах и в люнетах центральной части храма. На восточных столпах – «Благовещение», ниже помещены композиции «Спас Недрёманное Око» и «Моисей перед Неопалимой Купиной», в люнете южной стены – «Рождество Христово», в люнете северной стены – «Успение Богоматери». На центральном своде над хорами – «Сретение», «Крещение», «Воскрешение Лазаря» и «Вход Господень в Иерусалим», в люнете – «Преображение». Свод вимы (т.е. той или иной части храма, возвышенной над уровнем пола) занимает «Вознесение», ниже на стенах помещены «Распятие Христово» и «Сошествие во ад». Для всех композиций характерно включение множества дополнительных эпизодов. На щеке арки расположено «Сошествие Святого Духа»; вероятно, изначально в центре было изображение Богоматери. Роспись апсиды и прилегающих участков стен имеет четыре яруса. В конхе (полукупол, служащий для перекрытия полуцилиндрических частей зданий) центральной апсиды помещено изображение Богоматери с Младенцем на престоле (тип Одигитрии) и двух коленопреклонённых ангелов, на триумфальной арке – «Похвала Богородицы», на стенах рядом с конхой – огромные фигуры гимнографов Космы Маиумского и Иоанна Дамаскина. Ярусом ниже дано изображение Евхаристии, на стенах – «Тайная вечеря» и «Омовение ног». Ещё ниже написаны две композиции из «Деяний апостолов» – «Явление апостолу Петру сосуда с неба» (Деян 11. 12) и «Смерть Анании и Сапфиры» (Деян 5. 1–11).