Игуменами чаще всего назначались префекты и ректоры московских духовных школ, в том числе проповедник Славяно-греко-латинской академии Макарий (Сусальников; 1779–1782 гг.), префект академии Иннокентий (Полянский; 1782–1783 гг.), префект Перервинской духовной семинарии Ириней (Клементьевский; 1783–1784 гг.), префекты академии Моисей (Гумилевский; 1784–1788 гг.) и Геннадий (Шумов; 1808–1810 гг.). Префект Перервинской духовной семинарии Иннокентий (Смирнов), возглавлявший монастырь в 1810–1812 гг., был возведён в сан архимандрита в 1812 г., после назначения бакалавром в Санкт-Петербургской духовной академии по кафедре церковной истории, для «вящшаго поощрения его к усердному продолжению служения». За исключением инспектора Московской духовной семинарии игумена Феоктиста (Орловского; 1817 г.), с этого времени настоятелями были архимандриты: префект Московской духовной академии Парфений (Чертков; 1813–1814 гг.), ректор Вифанской духовной семинарии и Московского уездного духовного училища Неофит (Докучаев-Платонов; 1814–1816 гг.), ректор Заиконоспасского духовного училища Аполлос (Алексеевский; 1816–1817 гг.), инспектор Московской духовной академии Евлампий (Пятницкий; 1830–1831 гг.), инспектор Московской духовной академии Платон (Казанский; 1831–1833 гг.), ректор Вифанской духовной семинарии, позже Московской духовной семинарии Леонид (Краснопевков; 1850–1854 гг.), ректор Вифанской духовной семинарии, позже Московской духовной семинарии Игнатий (Рождественский; 1859–1863 гг.), инспектор, впоследствии ректор Вифанской духовной семинарии и Московской духовной семинарии Сергий (Спасский; 1863–1872 гг.); инспектор Вифанской духовной семинарии Кирилл (Орлов; 1872–1880 гг.). Со второй половины XIX в. из числа настоятелей часто избирались викарные епископы, в том числе архимандрит Кирилл (Орлов) и Макарий (Троицкий) были хиротонисаны в викарии Воронежской епархии, архимандрит Модест (Никитин) – в викарии Московской епархии. Среди настоятелей были переводчик игумен Софроний (Младенович; 1770–1776 гг.), переводчик архимандрит Гавриил (Альбицкий-Игнатьев; 1821–1825 гг.), духовный писатель и проповедник архимандрит Митрофан (Воронцов; 1839–1845 гг.), христианский философ архимандрит Серапион (Машкин; 1897–1900 гг.). До основания монастыря в храме в честь иконы Божьей Матери «Знамение» на старом государевом дворе служил большой клир. Исследователи полагают, что священником этого храма был поэт Савватий (с 1634 г. – справщик Московского Печатного двора). В XVII в., в период наибольшего расцвета Московского в честь иконы «Знамение» мужского монастыря, численность братии превышала 40 человек, например, в 1669 г. здесь проживали игумен, пять иеромонахов, два иеродиакона и 41 монах, а в 1677 г. – игумен, четыре иеромонаха, два иеродиакона и 34 монаха («Русская историческая библиотека», том 23).