При этом (в итоге) верность православию сохранили именно те архиереи, которые вступали в конфликты с братствами: Львовский Гедеон (Балабан) и Перемышльский Михаил (Копыстенский). В «артикулах» епископов-униатов содержится требование вернуть братства под власть епархиальных архиереев «по стародавнему обычаю», но королевская грамота подтвердила правомочность существования только тех церковных братств, которые признают верховенство Римского папы и своих епископов. После того как стали известны планы западнорусских епископов заключить унию с католической церковью, православные братства возглавили движение в защиту православия. На православном Брестском соборе в 1596 г. присутствовали представители более 20 братств, протестовавших против заключения унии (исследователям известна деятельность проповедника Виленского Троицкого братства Стефана Зизания, сначала боровшегося против планов унии, а после 1596 г. обличавшего униатских иерархов). Братства предпринимали совместные акции по защите православной веры. Одной из форм борьбы стали регулярные протесты в судах и сеймах коронных земель и Великого княжества Литовского против действий униатской иерархии и католических властей. Начиная с 1599 г., встречаются сведения о подписании соглашений о взаимопомощи, совместных действиях и денежных складчинах между 11 львовскими братствами во главе с Успенским для посылки объединенной делегации к королевскому двору. Виленское братство, изгнанное униатами из Свято-Троицкого монастыря и выстроившее Свято-Духов монастырь, помимо участия в подобных акциях печатало антиуниатскую литературу, противостояло нападкам со стороны виленской иезуитской коллегии. В начале XVII в. православные братства являлись организаторами сопротивления униатским властям в Вильно, Луцке, Слуцке, Полоцке и других городах. Они издали подавляющую часть антиуниатской и антикатолической литературы. Именно поэтому униатские архиереи настойчиво стремились подчинить себе союзы мирян или уничтожить их. Например, в Бресте местный епископ Ипатий (Потей) разогнал братство, отобрав у него школу и другое имущество. На рубеже XVI–XVII вв. основным покровителем братств стала православная шляхта. Церковные союзы при городских храмах оказались беззащитными перед действиями униатских архиереев, в то время как храмы, существовавшие на шляхетских землях, пользовались иммунитетом; но при переходе землевладельца в унию братство сразу же становилось униатским. Несмотря на запрет со стороны королевских властей, братства поддерживали связи с Константинопольскими патриархами и способствовали восстановлению православной иерархии в Киевской митрополии. Иерусалимский патриарх Феофан III (1608–1644 гг.), посетивший Киев в 1620 г., подтвердил привилегии ряда братств и даровал ставропигию Луцкому, Слуцкому и Киевскому православным братствам. С 1610 гг. союзником братств стало казачество; в 1620 г. казаки во главе с гетманом П.К. Сагайдачным вступили в состав киевского Богоявленского братства. Но с 1620 гг. влияние братств на церковную жизнь неуклонно падало, причиной чему был переход большой части православной шляхты в католичество и протестантизм, а низкий социальный статус братчиков не позволял эффективно бороться с униатами и государственной властью. В первой трети XVII в. усилилось значение духовенства в православных братствах. Киевский митрополит Иов (Борецкий) в 1628 г. предпринял попытку отменить особый статус ставропигийных братств и подчинить их епархиальным архиереям, однако потерпел неудачу. Деятельность митрополита Петра (Могилы) по упорядочению внутрицерковной жизни способствовала уменьшению значения братств. В результате церковных реформ епископы восстановили контроль над союзами мирян, братское духовенство при поддержке епархиальных архиереев получило возможность участвовать в выработке принимаемых братствами решений. Продолжая оставаться центрами просвещения и книгопечатания, церковные союзы мирян, тем не менее, потеряли самостоятельное значение. К середине XVII в. братское движение распалось, интересы братств замкнулись в рамках собственных приходов. Изоляция отдельных союзов, постоянное давление со стороны униатской церкви и католических властей, отсутствие могущественных светских покровителей постепенно приводили либо к переходу православных братств в унию (Львовское Успенское братство приняло унию в 1708 г.), либо к превращению братств в «медовые» союзы, либо к распаду.