Каменное строительство в Макариевом Калязинском монастыре началось в 1520 гг. В 1521 г. на средства дмитровского купца М.Г. Воронкова вместо деревянного храма построен и в июне 1523 г. Тверским епископом Акакием освящён пятиглавый каменный Троицкий собор. В него были перенесены и положены в каменную гробницу мощи основателя («Полное собрание русских летописей», том 22, часть 1).В 1525–1530 гг. была построена трапезная (не сохранилась) – самая ранняя из подобного вида гражданских построек в тверском зодчестве. Основу здания с высоким квадратным подклетом составлял большой квадратный зал, своды которого поддерживал свод в центре. К 1530 г. на средства дмитровского князя Юрия Ивановича на верхнем этаже трапезной была устроена церковь во имя святых князей Бориса и Глеба. В 1610 г. монастырь был разорён, с 1633 г. по приказу царя Михаила Фёдоровича отстраивался. На территории монастыря сложился уникальный архитектурный ансамбль. Руководство работами осуществляли московские зодчие отец и сын Марк Шарутин и его сын Иван Шарутин, имена которых были запечатлены в тексте закладных досок на главной воротной башне, также в них участвовал местный мастер Аверкий Мокеев, впоследствии крупнейший русский зодчий. В 1636 г. между собором и трапезной возвели колокольню, ставшую вертикальной доминантой комплекса. В 1641 г. были сооружены два двухэтажных корпуса – настоятельские покои и братские кельи. Троицкий собор, пострадавший во время польско-литовского разорения, после пребывания в монастыре царя Алексея Михайловича был восстановлен и перестроен в 1634–1655 гг. Кроме царских вкладов средства на строительство выделил старец Леонид (Высоцкий). К собору были пристроены северный придел и закрытая галерея-паперть, опоясавшая храм с запада, севера и юга. В пятиглавом соборе было два престола: тёплый южный в честь Нерукотворного образа Спасителя (перестроен в 1866 г.; иконостас 1762 г.; новый – 1812 г.) и северный в честь Рождества Пресвятой Богородицы (перестроен в 1870 г.; иконостас 1770 г.). В 1654 г. собор был расписан артелью «кормовых государевых живописцев» во главе с Симеоном Авраамовым. Фрески занимали 1 тыс. кв. м. В 1847 г. в росписи собора принимал участие Алексей Гаврилович Венецианов. В конце XIX в. фрески были переписаны мастерами под руководством академика Петра Петровича Покрышкина. Чугунные плиты пола Троицкого храма – вклад тестя царя Алексея Михайловича боярина Ильи Даниловича Милославского. В каменной церкви во имя святых князей Бориса и Глеба, возведённой в 1525–1530 гг., были два придела: правый во имя святых князей Бориса и Глеба и левый во имя преподобных Исаакия, Далмата и Фавста, а также трапезная и службы. В 1830 г. в перестроенном храме приделы были переименованы: правый – в честь Казанской иконы Божьей Матери и левый – в честь Сретения Господня. В храме стоял иконостас 1749 г. С южной стороны церкви находились библиотека и архив, под церковью – книжная лавка, просфорная, «провизные» палатки, два подвала. Трапезная, построенная в 1525–1530 гг. вместе с Борисоглебской церковью «трапезных дел мастером» Григорием Борисовым, имела центральное отопление. В 1633 г. она была перестроена зодчим Аверкием Мокеевым. На святых вратах располагалась каменная холодная церковь во имя преподобного Макария, устроенная в 1617 г. на средства кашинского купца Широкого-Машкина (одно из первых каменных зданий, возведённых после Смутного времени).