После смерти Бориса Годунова на престол вступил его 16-летний сын Фёдор Борисович. Царица-вдова Мария Григорьевна просила Иова «и весь Собор и боляр великих» о поддержке сына («Русская историческая библиотека», том 13). Патриарх с Собором «благословили великого государя царя и великого князя Фёдора Борисовича… на Московское государство и на все государьства всея Великия Росии». Иов послал окружную грамоту о воцарении Фёдора Борисовича. Патриарх направил в войско под Кромы Новгородского митрополита Исидора для того, чтобы тот принял присягу новому царю. Часть войска принесла присягу, но большинство полков 7 мая перешли на сторону самозванца. 1 июня 1605 г., когда войска Лжедмитрия приближались к Москве, посланники самозванца на Лобном месте зачитали грамоту Лжедмитрия москвичам, в которой была описана история «спасения царевича Дмитрия», москвичам обещались всевозможные льготы. В тот же день самозванец отправил в Москву послание, видимо, являвшееся ответом на рассылавшиеся по стране соборные грамоты. Называя Иова «изменником», Лжедмитрий порицал одновременно и весь «богоненавистный» освященный Собор (Полное собрание русских летописей, том 34). В Москве началось восстание в пользу Лжедмитрия, восставшие арестовали Фёдора Борисовича вместе с матерью и сестрой. 10 июня юный царь и царица Мария Григорьевна были убиты. Вскоре после их гибели подвергся поруганию патриарх, служивший литургию в Успенском соборе, был разграблен патриарший двор. Иов так описал эти события: «Множество народа царьствующаго града Москвы внидоша во святую соборную и апостольскую церковь со оружием и дреколием во время святого и Божественного пения... и внидоша во святый олтарь, и меня, Иева патриарха, из олтаря взяша во церкви, и по площади таская, позориша многими позоры». Тем не менее, согласно известию Летописного свода 1652 г. (отражающего особую редакцию «Нового летописца»), которое подтверждается свидетельствами иностранных авторов, патриарх приветствовал самозванца в Москве: «Лета 7113 вниде во град Москву… Гришка Отрепьев, патриарх же Иев изыде на Лобное место со кресты». В грамоте в Соль Вычегодскую Лжедмитрий писал, что «Иев, патриарх Московский и всеа Русии… и весь освященный Собор… узнав прироженного государя своего… в своих винах добили челом». Исследователи полагают, что, оказавшись в изоляции после гибели Фёдора Борисовича и не имея светских заступников, патриарх был вынужден пойти на соглашение с победителями. Возможно, поэтому за низложением Иова последовала ссылка на относительно мягких условиях – патриарх был отправлен по собственному выбору в Успенский монастырь в Старице. Иов был сведён с престола Петром Фёдоровичем Басмановым и другими советниками Лжедмитрия I, которые «приведоша его в соборную церковь и начаша снимати святительское платье». Лжедмитрий I дважды требовал, чтобы Иов благословил себе преемника – грека Игнатия, но патриарх отказался и «с поношением к розстриге говорил, яко по ватаге и атаман, по овцам и пастырь». По свидетельству князя Ивана Михайловича Катырева-Ростовского, одновременно с патриархом было послано в заточение много иноков Чудова монастыря, которые помнили расстригу («Русская историческая библиотека», том 13).