В 1859 г. он был переведён на должность чиновника для контроля в Киргизской степи той же комиссии, с апреля по сентябрь того же года участвовал в экспедиции по восточному берегу Каспийского моря и в переговорах с туркменами. В 1860 г. в Казанском университете была воссоздана кафедра турецко-татарского языка, по инициативе ректора Александра Михайловича Бутлерова совет университета просил назначить на должность профессора Н.И. Ильминского. 6 сентября 1861 г. приказом министра народного просвещения он был назначен исправляющим должность экстраординарного профессора, в 1863 г. утверждён в должности. В 1867–1872 гг. редактировал «Учёные записки Казанского университета». Одновременно в 1863/1864 и с 1865/1866 до конца 1869/1870 учебных годов Н.И. Ильминский был экстраординарным профессором татарского и арабского языков Казанской духовной академии; в 1864/1865 учебном году не преподавал из-за конфликта с ректором архимандритом Иннокентием (Новгородовым). Н.И. Ильминский был уволен из академии после введения устава 1869 г. и сокращения вакансий востоковедов. В 1872 г. оставил службу в университете. В том же году добился от министра народного просвещения Дмитрия Андреевича Толстого открытия Казанской инородческой учительской семинарии (с 1884 г. – Казанская учительская семинария), 19 августа утверждён её директором, занимал эту должность до конца жизни. В 1870 г. Н.И. Ильминский был избран членом-корреспондентом Санкт-Петербургской Академии Наук, в 1875 г. – почётным членом Казанской духовной академии. В 1881 г. Санкт-Петербургская Академия Наук предлагала ему звание академика по востоковедению, но Н.И. Ильминский отказался, т.к. звание академика требовало постоянного проживания в столице и лишало его возможности руководить Казанской инородческой учительской семинарией и заниматься миссионерской деятельностью. После тяжёлой болезни скончался в своей казённой квартире. В Захарие-Елизаветинской церкви Казанской учительской семинарии его отпевал Чебоксарский епископ Никанор (Каменский). Н.И. Ильминский был похоронен у правого придела церкви во имя Ярославских чудотворцев на Арском кладбище Казани, могила сохранилась и почитается верующими, особенно кряшенами и чувашами. Архив Н.И. Ильминского по поручению Гурия Казанского святителя братства систематизировал Пётр Васильевич Знаменский (ныне хранится в Национальном архиве Республике Татарстан). Переводческая, педагогическая и миссионерская деятельность Н.И. Ильминского были тесно взаимосвязаны. Первоначально его интерес был направлен на изучение ислама, религиозной и бытовой жизни мусульман Поволжья и на формирование противомусульманской миссии. Этому были посвящены его небольшие работы в 1850 гг.