В Смутное время Мефодиев Пешношский монастырь был разорён отрядами польско-литовских интервентов. По преданию XIX в., до 1612 г. мощи преподобного Мефодия были «на вскрытии», но из-за угрозы осквернения их поместили под спудом, а в 1623 г. они находились в деревянной часовне. В 1805–1806 гг., во время строительных работ, были найдены надгробия с высеченными именами замученных в Смутное время насельников: двух иеромонахов, двух священников, иеродиакона, шести схимонахов и семи монахов. К 1617 г., при игумене Ионе, в обители возобновились богослужения. В 1620 г. царь Михаил Фёдорович выдал строителю (1620–1633 гг.) Нектарию (Вязмитину) грамоту, которой разрешал выплачивать ругу не из Москвы, как прежде, а из пошлинных денег села Рогачёва. Согласно описи 1623 г., на территории Мефодиева Пешношского монастыря находились собор Николая Чудотворца с приделом Леонтия Ростовского и папертью, Сретенская церковь с трапезной и двумя келарскими палатками, колокольня с Богоявленской церковью, ограда, «палатка» над могилой епископа Гурия (Заболоцкого), игуменская и семь монашеских келий, дом привратника, две поварни, квасоварня, погреб, ледник и другие подсобные помещения. В 1653 г., при игумене Тихоне, царь Алексей Михайлович прислал в Никольский собор напрестольное Евангелие. В записи на титульном листе царь именовал Пешношу «Царским богомольем». В царской грамоте 1648 г. упоминаются «отличные вкладчики» Василий Михайлович Ртищев, а также бывший енисейский воевода Никифор Логинович Верёвкин (ум. в 1676 г.), который пожертвовал обители несколько деревень и принял в ней постриг с именем Нифонт. В 1676 г. монастырь у стольника Ивана Яковлевича Колычева приобрёл двор в Москве для устроения подворья. В конце XVII в. часть доходов монастыря шла на содержание Славяно-греко-латинской академии. 11 апреля 1700 г. решением Синода и 30 мая того же года указом царя Петра I Мефодиев Пешношский монастырь был приписан к Троице-Сергиеву монастырю, который назначал для управления обителью строителей. По наказу Большого дворца 11 мая того же года в Мефодиев Пешношский монастырь прибыли подьячий В. Абросимов с троицким иеромонахом Исаией (Даниловским) и со слугой Г. Приклонским. Они составили опись храмов, ризницы, библиотеки и хозяйственных построек. Среди владений монастыря упомянуты три мельницы на реках Пешноше, Сестре и Рогачёвке. В одном из помещений обнаружили десять карабинов, восемь ружей, четыре пищали, шесть пистолетов, две сабли и две чугунные пушки на станках, оставшиеся, вероятно, после литовского нашествия. Монастырскую казну (1900 руб.) запечатали и вывезли в Москву, оставив монастырю 28 руб. 19 алтын и 3 деньги. 26 февраля 1729 г. троицкие архимандрит Варлаам (Высоцкий), келарь монах Иосиф (Бурцев) и казначей Нектарий (Титов) сообщили в Синод, что крестьяне Мефодиева Пешношского монастыря «упрямством своим не платят денежный погодный оброк... уже два года» (Отчёт о движении денежных средств, том 8). Строитель (1730–1734 гг.) Август (Старков) безуспешно ходатайствовал о возвращении монастырю самостоятельного статуса.