Из грамоты Московского митрополита Феодосия (Бывальцева) исследователи сделали вывод, что в 1461–1464 гг. в Мефодиевом Пешношском монастыре, власти которого состояли с ним в переписке, действовал общежительный устав («Акты исторические», том  1). В конце XV – первой половине XVI вв. Мефодиев Пешношский монастырь считался обителью, братия которой была духовно близка к идеям преподобного Иосифа Волоцкого. Настоятели Мефодиева Пешношского монастыря тесным образом были связаны с московским Симоновым в честь Успения Пресвятой Богородицы и Саввиным Сторожевским в честь Рождества Пресвятой Богородицы монастырями; игумены Мефодиева Пешношского монастыря нередко занимали архиерейские кафедры. В начале XVI в. настоятелем обители был игумен Васиан II (Санин), будущий Ростовский архиепископ, а затем постриженики Иосифова Волоколамского монастыря: после июня 1511 г. – игумен Вассиан (Топроков), с конца 1520 гг. – Гурий (Черлёного Заболоцкий; до 16 марта 1539 г.; будущий епископ Смоленский), Трифон (Ступишин; 1542–1544 гг.; будущий епископ Полоцкий) и Варсонофий (1543–1555 гг.; будущий епископ Тверской). 6 февраля 1539 г., во время настоятельства игумена Гурия (Заболоцкого), обитель получила от великого князя Ивана IV Васильевича ружную грамоту. В середине – второй половине XVI в. в связи с ослаблением влияния при царском дворе иосифлян понизился и статус Мефодиева Пешношского монастыря. Так, несмотря на льготную грамоту 1547 г., уже в 1548 г. царь Иван IV Васильевич обязал власти Мефодиева Пешношского монастыря платить в государеву казну ямские деньги. 4 июня 1549 г. по новому царскому указу обитель лишилась права беспошлинной торговли в Дмитрове, Кимрах и Рогачёве («Русская историческая библиотека», том 32). В мае 1553 г. по пути в Кириллов Белозерский в честь Успения Пресвятой Богородицы мужской монастырь царь Иван IV Васильевич посетил Мефодиев Пешношский монастырь, беседовал с племянником преподобного Иосифа Волоцкого бывшим Коломенским епископом Вассианом (Топорковым), который находился здесь на покое. Согласно версии боярина князя Андрея Михайловича Курбского, этот иосифлянин убеждал царя: «...Аще хощеши самодержец быти, не держи собе советника ни единаго мудреишаго собя, понеже сам еси всех лутчши» («Русская историческая библиотека», том 31). Удовлетворённый ответом царь вскоре пожаловал властям Мефодиева Пешношского монастыря на содержание крупное село Суходол с 25 деревнями. 10 марта 1555 г. от Старицкого князя Владимира Андреевича монастырь получил льготную грамоту на право беспошлинной покупки соли в селе Кимре. исследователи полагают, что другой причиной упадка авторитета Мефодиева Пешношского монастыря стало снижение дисциплины и нарушение монастырского устава богатыми вкладчиками и пострижениками. В 1578 г., критикуя внутренние порядки в Кирилловом Белозерском монастыре, царь Иван IV Васильевич заметил, что здесь «ныне, грех ради наших, хуже и Песноши, как дотудова Песношь бывала» («Акты исторические», том  1).