В конце XVI – начале XVII вв., с оформлением обширных колониальных владений, открылись трибуналы в Новом Свете: в Лиме и Мехико (1569 г.) и в Картахене (в современной Колумбии, 1609 г.). Деятельность испанской инквизиции имела целью, прежде всего, искоренение криптоиудаизма. До середины XVI в. конверсо составляли около 90% всех жертв трибуналов. В выявлении ереси трибуналы использовали специальное руководство, где были перечислены 37 признаков «Моисеевой ереси» (омовение рук перед едой и молитвой, смена одежды в субботу, отказ от мяса, отказ от исповеди, зажигание субботних свечей, отказ от разжигания огня в субботу и в дни еврейских праздников и др.). Изгнание евреев из Испании в 1492 г., мотивированное вредным влиянием, которое они оказывали на конверсо, привело к сокращению криптоиудейских практик (в частности, к отказу от обрезания и обязательного потребления кошерных продуктов): конверсо были лишены поддержки еврейских общин, доступа к еврейским книгам, консультаций с раввинами, языковой практики и т.д. В условиях преследований королевской властью и инквизицией криптоиудаизм постепенно сходит на нет: к концу XVI в. процент дел против конверсо сократился. Однако в 1580 г., после вхождения Португалии в состав Испании, испанская инквизиция стала активно заниматься португальскими криптоиудеями, которые бежали в Испанию от более жестоких гонений португальской инквизиции. Сокращение процессов против криптоиудеев, вызванное тем, что последние были уничтожены, эмигрировали или ассимилировались, происходило уже в XVIII в. одновременно со спадом деятельности инквизиции. Другой крупной группой, преследуемой испанской инквизицией, были мориски – крещёные мусульмане, чья численность возросла после насильственного обращения в христианство всех мавров Кастилии (1502 г.) и Арагона (1526 г.). Инквизиция стала особенно активно заниматься морисками с 1568 г., когда те подняли восстание в Андалусии, подавленное лишь через два года, и до 1609 г., когда они были изгнаны из Испании. Кроме «новых» христиан еврейского и мусульманского происхождения испанская инквизиция в XVI–XVII вв. занималась преследованием немногочисленных в Испании протестантов, концентрировавшихся, в основном, в Севилье и Вальядолиде, сторонников мистического движения алюмбрадов («просвещённых»), гуманистов, в том числе последователей Эразма Роттердамского, а также тех, кто подозревались в приверженности народным суевериям, магическим практикам и сатанизму (ведовству и колдовству). В XVIII в. деятельность инквизиции была направлена против просветителей и масонов. За время существования инквизиции, по данным имевшего доступ к её архивам историка Хуана Антонио Льоренте, были «отпущены», т.е. переданы светской власти и казнены через сожжение, около 30 тыс. человек, сожжены «в изображении» около 17 тыс. человек, получили «примирение» с католической церковью (т.е. приговорены к тюремному заключению, галерам, работе на рудниках, проживанию в определённых городах, епитимиям и штрафам) около 300 тыс. человек.