Однако после нападения разбойников на незащищённую пустынь и кончины от полученных ран монаха Матфея преподобный Лукиан вернулся в Чудов монастырь. Здесь он познакомился с царским «истопничим» Алексеем Фёдоровичем Борковым. В 1648 г. А.Ф. Борков и переславец Тимофей Микулаев (Николаев) подали царю Алексею Михайловичу челобитную с просьбой разрешить иеромонаху Лукиану с братией жить при храме, «потому что около тое церкви верст по пяти и по шти и болше пусто, лесом поросло и болото, жилых сел и деревень нет, и впредь тут в приходе за пустотою быть некому» (Исторический музей). В 1649 г. в пустыни на средства купцов гостиной сотни Г. Шевелёва, Т. Рабенского, И.Г. Шильцова, царского садовника О.Б. Горлова и некоего монаха Чудова монастыря Феодора-иноземца был построен новый храм в честь Рождества Пресвятой Богородицы. Некоторые вкладчики пустыни стали её первыми насельниками. По грамоте царя Алексея Михайловича 1649/1650 г. преподобный Лукиан был назначен строителем обители, которой отошли пашня, «сенные покосы и прочия угодья», «чем прежние попы владели» (список с грамоты: Исторический музей). 28 августа 1650 г. преподобный Лукиан получил благословение патриарха Иосифа совершать богослужения в пустыни (Исторический музей; помета с разрешением). В новый храм перенесли иконы из древней церкви. Кроме того, преподобный Лукиан привёз из Москвы Страстной образ Божьей Матери (впоследствии он размещался в местном ряду иконостаса слева от царских врат), местные и пядничные иконы, несколько колоколов. В монастыре преподобный ввёл общежительный устав. После преставления преподобного Лукиана (8 сентября 1654 г.) обязанности строителя исполнял иеродиакон Онуфрий. В это время братии в монастыре было немного. Как повествует «Чудо о хотящих монастырь разграбити и братию всю оружием смерти предати» из «Сказания о явленной иконе Рождества», вскоре после преставления преподобного, зимой 1654/1655 гг., было совершено нападение на обитель: разбойники приехали ночью на санях, но как только приблизились к воротам, «неведомая сила ударила их», двое остались лежать парализованными, и утром их обнаружили монахи (Исторический музей). Другая попытка «церковь окрасти» также была пресечена чудесным образом: разбойники увидели крестный ход вокруг стен Лукиановой пустыни, возглавляемый царём (Исторический музей). Окрестные землевладельцы пытались помешать строительству монастыря. Давыд Корнилович Дерябин, дьяк приказа Большого дворца (с 20 февраля 1647 г. по 18 апреля 1657 г.), чьё поместье находилось за трёх «малых поприща» от обители, в селе Рюминском, «нача пакости творити», но был наказан тяжёлой болезнью. Осознав своё согрешение, он пожертвовал в монастырь большую денежную сумму серебром (дьяк не напрасно опасался за своё поместье: впоследствии по грамоте царя Фёдора Алексеевича от 1 июня 1680 г. Лукианова пустынь получила 14 пустошей, относившихся к селу Рюминскому). Поскольку иеродиакон Онуфрий был неграмотным и не вполне справлялся с обязанностями настоятеля, 13 мая 1658 г. по выбору братии и по благословению патриарха Никона (Минова) строителем и духовником пустыни был утверждён иеромонах Корнилий (преподобный Корнилий Александровский).