Братство было создано без разрешения короля (на это указывал властям униатский митрополит Иосиф Вельямин Рутский, который писал, что Киевское братство ведёт активную борьбу против униатов). Лишь 19 февраля 1629 г. король Сигизмунд III в ответ на просьбу православной шляхты Киевского воеводства и земских послов дал разрешение на «основание» Киевского братства с храмом и госпиталем. В предисловии к «Упису» изложены основы деятельности Киевского братства. В документе сказано, что в Киеве по благословению и по повелению Константинопольского патриарха Тимофея II, а также Александрийского, Антиохийского и Иерусалимского патриархов создано «душеспасательное друголюбное соединение – братство церковное» (в XIX в. считалось, что упоминание патриархов в предисловии к «Упису» означает предоставление Киевскому братству ставропигии, но в те годы у православных в Речи Посполитой не было епархиальных архиереев, поэтому благословить создание братства мог только один из православных патриархов). Отмечено, что образцом киевские братчики считали уставы Львовского, Виленского, Могилёвского и других братств. Целью создания Киевского братства было «утешение и утверждение в благочестии российскому роду сыном всходнего православия». Подробного перечня «повинностей и порядков» членов братства в «Уписе» нет. «Святое милосердное братство» должно было содействовать его членам в утверждении в благочестии, обучать полезным наукам, защищать вдов и сирот, оказывать помощь «падшим» людям, важными функциями были организация школы, больницы и др. (в связи с каритативной функцией Киевского братства исследователи считают необходимым отметить существование в Речи Посполитой с XVI в. католических братств «святого милосердия»). Ставилась задача содействовать утверждению «честнаго иноческаго жития», вероятно, под опекой братства должен был находиться Богоявленский монастырь. Братчики были обязаны финансировать деятельность объединения и защищать его, для каждого члена братства был определён размер взноса в зависимости от материального достатка. Так, Даниил Стрибиль обязался давать 10 золотых ежегодно, Григорий Дегиловский – лошадь или «камин воску» (24 фунта), Иван Путята – «що буде можна» и т.п. В «Уписе» названы по именам первые члены Киевского братства: будущие Киевские митрополиты – архимандрит Киево-Печерского монастыря Пётр (Могила; вступил 11 марта 1631 г.) и префект киевских братских школ Сильвестр (Косов), наместник монастыря Николая Иоиль, архимандрит Трёхтемировского монастыря Иосиф (Курцевич), иеромонахи Феодосий (Оранский), Антоний (Горбацкий) и Иоиль, будущий Луцкий и Острожский епископ Афанасий (Пузына), киево-печерские иноки Исаия (Трофимович-Козловский), Софроний (Почаский), Антоний (Пацевский), Афанасий (Ивашковский), Иларион (Симовский), Арсений (Бережницкий), будущий архимандрит Киево-Печерского монастыря Захария (Копыстенский; вступил 4 января 1616 г.), шляхтичи (?) Андрей Литинский (выходец из Галиции), Даниил Стрибиль, Григорий Дегиловский, младший братчик Иван Путята. Некоторые имена (Иосифа (Курцевича), Петра (Могилы), Сильвестра (Косова) и др.) были внесены в документ после 1616 г. Из сочинений Кассиана Саковича исследователям известно, что в Киевское братство вступил гетман П.К. Сагайдачный со всем Запорожским войском, сделав для братства значительное пожертвование.