С начала 540 гг. Юстиниан стал глубже входить в богословские вопросы: стремление к преодолению монофизитства и прекращению раздора в церкви не оставляло его. Между тем императрица Феодора продолжала покровительствовать монофизитам, и в 541 г. по просьбе шейха арабов-гассанидов аль-Харита способствовала становлению монофизитской иерархии через поставление странствующего епископа Иакова Барадея (490/505 – 578 гг.). Юстиниан поначалу старался поймать его, но это не удалось, и императору впоследствии пришлось смириться с деятельностью Барадея на окраинах империи. Хотя императрица Феодора, как считают, скончалась, примирившись с православной церковью, есть версия, согласно которой она завещала императору не преследовать видных монофизитов, всё это время укрывавшихся в Константинопольском дворце папы Гормизда. Так или иначе, православный император не усилил гонения на монофизитов, а старался собрать верующих в единой церкви путём осуждения ложных учений. Около начала 540 гг. император поднял вопрос о формальном осуждении учения Оригена (около 185 – около 254 гг.). Для этого он в 543 г. созвал в столице церковный Собор, который осудил Оригена и его учение. Одновременно императорский богословский советник Феодор Аскида предложил осудить некоторые сочинения блаженного Феодорита Киррского (386/303–457 гг.), Ивы Едесского (ум. в 457 г.) и Феодора Мопсуетского (около 350 – 428 гг.), в которых выражались несторианские заблуждения. Хотя сами авторы (уже давно скончавшиеся) пользовались уважением в церкви, соборное осуждение их ошибочных взглядов лишило бы монофизитов возможности клеветать на православных, обвиняя их в несторианстве. В 544 г. Юстиниан обнародовал эдикт против так называемых «Трёх глав» – неправославных сочинений названных выше учителей. Однако вместо примирения монофизитов с церковью это вызвало протест на Западе, где в осуждении «Трёх глав» увидели покушение на православие. Константинопольский патриарх Мина (536–552 гг.) подписал императорский указ, но папа Римский Вигилий (537–555 гг.) долго не соглашался и даже пошёл на разрыв общения с Константинопольской церковью. В 552 г., во время подготовки к Собору, призванному решить новый спор, патриарх Мина скончался. Тогда же император Юстиниан удостоился видения, в котором ему явился апостол Пётр и указал на святителя Евтихия как на наследника Мины. Это утвердило убеждённость православных в Константинополе, Евтихий был поставлен в патриархи (552–565 гг.; в первый раз), а в следующем году в столице собрался Пятый Вселенский собор. При деятельном участии императора было достигнуто соглашение с делегатами Западной церкви, и Собор осудил несторианские сочинения Феодорита Киррского, Ивы Едесского и Феодора Мопсуетского, а также учение Оригена. Призванный установить церковный мир, Пятый Вселенский собор в этом деле так и не преуспел. Православного Александрийского патриарха Аполлинария (551 – около 5698 гг.) по-прежнему продолжали признавать лишь небольшая часть египтян греческого происхождения, а коренные жители этой провинции (копты) избрали своего коптского патриарха (см. Вселенские соборы). Недовольство решением Собора тлело и на Западе, но император Юстиниан поставил на Римский престол Пелагия I (556–561 гг.), который принял решение о «Трёх главах» и со временем добился их признания в Западной церкви. После ухудшения внешнеполитической обстановки в 540 гг. империя вновь перешла в наступление, добившись успехов в Африке, Италии, Испании и на Кавказе. Империя долго вела борьбу со взбунтовавшимися в Африке войсками, которые надеялись на передел вновь покорённых земель. Лишь в 548 г. удалось успешно подавить мятеж, после чего Северная Африка прочно вошла в состав империи.