Окончательно полемика XV – первой половины XVI в. о двоеперстии и троеперстии была закрыта Стоглавым Собором 1551 г. В главе 31 Стоглава двоеперстие признано единственной возможной формой перстосложения; в тексте содержатся выписки из проложного сказания о Мелетии Антиохийском и из Феодоритова Слова. Решения Стоглавого Собора рассылались по Руси в виде наказных списков. Во второй половине XVI – первой половине XVII вв. РПЦ придерживалась строгой позиции о двоеперстии как о единственно правильном перстосложении; вопрос о двоеперстии, в частности, поднимался в послании Московского Иова к грузинскому митрополиту Николаю и в речах российских послов в Грузии в 1637 г. Старец Арсений Суханов, побывав по поручению патриарха Никона на греческом Востоке, вступал с греками в полемику о двоеперстии, что изложено в его «Статейном списке». Статьи о двоеперстии, жёстко обличающие его противников, содержатся во многих старопечатных изданиях, выпущенных в России, на Украине, в Сербии. Такая позиция вызывала неприятие у некоторых представителей греческих церквей (поскольку она подразумевала критику троеперстия, которая интерпретировалась как хула на придерживавшиеся троеперстия греческой церкви), – например, исследователям известно, что в 1650 г. на Афоне греки сожгли несколько московских и сербских книг, которые учили о двоеперстии. Установление троеперстия в РПЦ связано с именем патриарха Никона, желавшего добиться полного соответствия между русской и греческой литургическими практиками. В 1653 г., перед началом Великого поста (т.е. до 20 февраля), по церквам Москвы была разослана «Память», в которой патриарх Никон, в частности, предписывал креститься троеперстно. У части духовенства «Память» вызвала резкую отрицательную реакцию, которая впоследствии и легла в основу старообрядческого раскола. Сохранение двоеперстия вместе с другими особенностями дониконовской богослужебной практики стало главным знаменем старообрядчества. В преобразованиях, включая замену двоеперстия при крестном знамении троеперстием, а при благословении – именословным перстосложением, патриарх Никон опирался на авторитет греческих церквей и стремился заручиться поддержкой восточных иерархов. В марте-апреле 1654 г. был проведён Собор, признавший необходимость исправлять богослужение по гречскому типу. 12 июня 1654 г. патриарх Никон отправил Константинопольскому патриарху Паисию грамоту, состоявшую из 27 вопросов; вопрос 24 был посвящён двоеперстию. Ответ на эту грамоту пришёл в 1655 г.; патриарх Паисий, в частности, писал о маловажности такого обрядового аспекта, как перстосложение, – лишь бы это не вредило единству церкви (тем не менее, патриарх Паисий высказался в пользу троеперстия как древнего обычая). Не дожидаясь ответа патриарха Паисия, патриарх Никон в марте 1655 г. предпринял несколько действий для замены двоеперстия троеперстием: в неделю Православия (в 1655 г. – 5 марта) он, сказав проповедь против двоеперстия, призвал в свидетели присутствовавшего в храме Антиохийского патриарха Макария, который отвечал Никону, что в Антиохии никто не крестится двоеперстно; на пятой седмице Великого поста (в 1655 г. – 25–31 марта) он провёл Собор с участием Антиохийского патриарха Макария и Болгарского патриарха Гавриила, на котором, в частности, было принято положительное решение по вопросу о необходимости перехода к троеперстию.