Третий период (1621–1636 гг.) стал временем упадка и ликвидации Острожской академии (о её деятелях в эти годы почти нет свидетельств). Исследователи связывают упадок академии с деятельностью дочери князя Александра Острожского Анны Алоизы Ходкевич, вследствие усилий которой в 1623 г. в Остроге открылась иезуитская миссия. В «Острожском летописце» сказано, что княгиня «много зла сотворила православным». Иезуит Ян Велевицкий в дневнике отмечал, что раньше жителями Острога были «одни только русины-схизматики» и только активное содействие Анны Алоизы, предоставившей значительный фундуш иезуитам, дало им возможность утвердиться в городе. В 1621 г. Анна Алоиза попыталась отдать Суражскую волость иезуитам, что вызвало возмущение православных. В 1622 г. она выкупила у епископа Афанасия (Пузыны) аренду Суражской волости и пообещала выплачивать госпиталю 2 тыс. злотых ежегодно. 22 января 1623 г. в письме к «русским бакалярам» Анна Ходкевич запретила им преподавать «по-польски и по-латинськи, только по-руски». Всё это привело к понижению статуса Острожской академии до начальной школы. Исследователи полагают, что княгиня нашла возможность передать деньги из фундуша своего деда, князя К.К. Острожского, на нужды школы при острожском костёле. В фундушной грамоте княгини от 25 октября 1624 г. записано: «А для воспитания детей в христианской набожности и освобождённых науках согласно воле князя Константина... из фонда на Суражу, предназначенного на школы греческую и латинскую, позволяю и предоставляю прикостельной католической школе половину той фундации, то есть 180 злотых». Заручившись поддержкой папы Римского Урбана III, Анна Алоиза в 1633 г. попыталась окончательно отобрать Суражский фундуш, что вызвало возражения епископа Афанасия (Пузыны), который подал протест в Луцкий гродский суд (Архив Юго-Западной Руси). Решающими для Острожской академии стали события 1636 г., когда во время Пасхи Анна Алоиза спровоцировала восстание православных острожских мещан. После жестокого подавления восстания в городе были ликвидированы православные институты, и введена уния (событие отразилось в анонимном стихотворном произведении «Лямент в утрапєню острожских мещан»). Острожская академия перестала функционировать. Назначенный ей князем К.К. Острожским фундуш в 1640 г. окончательно отошёл иезуитскому коллегиуму. Исследователи отмечают, что значение Острожской академии для развития православной церкви и культуры на восточнославянских землях невозможно переоценить. Противостоя пропаганде католицизма и унии, острожские богословы излагали обоснование истинности православия, спасительности православной церкви, её верности христианским догматам и канонам. Проводилась мысль, согласно которой борьба за православную веру является повторением Христовых мук и страданий первых христиан. Острожские интеллектуалы много сделали для защиты юлианского календаря. Также ставилась задача очистки православной веры от протестантских идей, иудаистских воззрений и др. При этом острожские книжники порой публиковали апокрифические тексты (о Флорентийской унии). Считается, что за 60 лет Острожскую академию окончили не меньше 500 человек. Воспитанники Острожской академии внесли решающий вклад в упрочение позиций православной церкви в Киеве, Вильно, Слуцке и в других центрах Речи Посполитой.