В 1740 г. Святейший Синод удовлетворил прошение прихожан о переводе к ним священника Тимофея Симеонова, «с производством в протопопы», поскольку их церковь «в прошлых годах была соборною». Раньше, в 1716–1736 гг., священник Тимофей служил в церкви Рождества Пресвятой Богородицы; с его именем связано начало общегородского почитания санкт-петербургского списка Казанской иконы Божьей Матери, хранившегося в этой церкви (впоследствии храмовая икона Казанского собора). 14 июля 1740 г. последовал указ императрицы Анны Иоанновны о строительстве каменного храма за алтарём мазанкового Успенского собора, на участке, который раньше занимало подворье митрополита Стефана. По преданию, его главный престол предполагалось посвятить св. Иоанну Крестителю, чьё имя носили отец императрицы Анны и её новорождённый внучатый племянник принц Иоанн Антонович, унаследовавший престол после её кончины 17 октября 1740 г. Каменный собор возводился по проекту архитектора Пьетро Антонио Трезини, хотя исследователи не исключают, что постройку начал Михаил Григорьевич Земцов. Задуманный «немалым и весьма непростым зданием», он должен был иметь одну главу и увенчанную шпилем колокольню, наподобие собора Петропавловской крепости. К 25 ноября 1741 г., когда произошёл очередной дворцовый переворот, едва успели возвести стены храма. О завершении строительства собора перед императрицей Елизаветой Петровной ходатайствовал один из старейших местных прихожан, гоф-интендант, действительный статский советник Иов Григорьевич Микулин. 5 апреля 1742 г. императрица повелела достроить «Успенскую соборную церковь вчерне под кровлю» и выдать для этого 7 тыс. руб. из соляных сборов. Однако строительство было приостановлено, хотя запас материалов позволял завершить работы. В 1743 г. при освидетельствовании собора было отмечено, что его алтарь обращён не на восток. Первый епископ Санкт-Петербургский Никодим (Сребницкий) подал представление в Синод о том, что было бы убыточно перестраивать каменный храм подобной величины. В то же время мазанковый Успенский собор быстро приходил в аварийное состояние: в 1740 гг., во время службы, в нём дважды обваливался потолок. По докладу И.Г. Микулина 15 апреля 1747 г. последовало Высочайшее соизволение на продолжение строительства. При этом императрица Елизавета Петровна потребовала сделать собор пятиглавым по образцу Успенского в Московском Кремле: храм должен был не только символически, но и зрительно представлять собор, служивший эталоном церковного строительства на Руси. По специально присланным архитектором Алексеем Петровичем Евлашевым в Канцелярию от строений материалам П.А. Трезини переработал первоначальный проект одноглавой церкви, но чертежи храма «о пяти главах» остались невостребованными. Прихожане Успенского собора с трудом поддерживали ветшающий мазанковый храм. Если в конце 1730 гг. в приходе числились 2,5 тыс. человек, в 1749 г. их оставалось немногим больше 1 тыс., а в 1762 г. – всего 689 человек. В октябре 1752 г. наводнение нанесло храму такой урон, что его боковые приделы пришлось упразднить, и он стал однопрестольным. Только в начале царствования императрицы Екатерины II в 1765 г.