Канцлером стал Уильям Сесил (1520–1598 гг.), государственный секретарь и ближайший советник королевы, выпускник кембриджского Сент-Джонс-колледжа. Кафедру архиепископства Кентербери последовательно занимали кембриджские теологи М. Паркер (1559–1575 гг.), Эдмунд Гриндал (1576–1583 гг.) и Джон Уитгифт (1583–1604 гг.). Официально признанной богословской доктриной в университете стал так называемый via media – серединный путь между католичеством и более радикальными протестантскими течениями. Вместе с тем Кембридж был одним из главных центров становления пуританизма, среди преподавателей университета были богословы, которые стремились очистить Англиканскую церковь Англии от остатков католицизма в обрядности и упразднить епископат. Лидером этого движения был Томас Картрайт (с 1569 г. – профессор теологии в Кембридже). В лекциях он утверждал, что церковная епископальная структура противоречит Священному Писанию. Чтобы предотвратить распространение пуританских идей, в 1570 г. по инициативе вице-канцлера Дж. Уитгифта (позднее он стал архиепископом Кентерберийским) были утверждены новые статуты университета, согласно которым все преподаватели и студенты должны были принадлежать к какому-либо колледжу, одновременно существенно расширялись полномочия глав колледжей и университетского руководства. В декабре 1570 г. Т. Картрайт был лишён профессорской кафедры, а два года спустя исключён из университета. В Кембридже учились и основатели конгрегационализма Роберт Браун и Генри Бэрроу. Несмотря на принятые меры, в конце XVI – начале XVII вв. пуритане по-прежнему были довольно многочисленны в Кембридже. Особенно сильны были их позиции в Крайстс-колледже и в новых Эмманьюэл-колледже и Сидни-Сассекс-колледже. Много выпускников Эмманьюэл-колледжа было среди английских эмигрантов в Северной Америке. При участии одного из них, пастора-конгрегационалиста Джона Гарварда был основан колледж в поселении Нью-Таун (ныне Гарвардский университет), которое в 1638 г. было переименовано в Кеймбридж. Вместе с тем большое влияние на англиканское богословие в правление королевы Елизаветы I Тюдор и короля Якова I Стюарта (1603–1625 гг.) оказывал кальвинизм. В Кембридже печатали труды европейских кальвинистов Теодора Безы (в 1581 г. он послал в дар университетской библиотеке кодекс Безы), Захарии Урсина, их английских последователей (Уильяма Перкинса и др.). Одновременно Кембридж был и центром противников учения об определении (так называемых английских арминиан). Среди их лидеров были французский иммигрант П. Баро, С. Харснетт, Л. Эндрюс, У. Баррет. Многие лидеры Английской революции и идеологи парламентской партии (в том числе Оливер Кромвель, Джон Мильтон и др.) были выпускниками Кембриджа, однако в самом университете большинство составляли роялисты. После победы парламента в руководстве университета и колледжей прошли масштабные «чистки», однако учебный процесс в Кембридже был затронут мало. В этот период в университете сложился кружок философов, богословов и моралистов – кембриджские платоники. Со второй половины XVII в. на первый план в университете выходит преподавание математики и естественных наук. Ведущим преподавателем в Кембридже в это время был Исаак Ньютон. Создавались новые кафедры – математики, астрономии, физики, химии, геологии, анатомии, ботаники, музыки и др.; открылись ботанический сад, музей естественной истории, обсерватория. Выпускником Кембриджа был Чарлз Роберт Дарвин. Кавендишская лаборатория (основана в 1871 г.) сыграла важную роль в развитии физики.