В 1862 г., после кончины Моисея (Путилова), были проведены выборы нового настоятеля под руководством ректора Калужской духовной семинарии архимандрита Герасима (Добросердова; впоследствии Астраханский епископ). Большинство братии высказалось за то, чтобы обитель возглавил иеромонах Пафнутий (Осмоловский), однако присутствовавший при этом Калужский епископ Григорий, руководствуясь мнением старцев Макария и Амвросия, сделал выбор в пользу Исаакия, который 19 июля 1862 г. был утверждён в должности. Впоследствии епископ Григорий продолжал покровительствовать ему. Группа духовных детей иеромонаха Пафнутия была недовольна решением архиерея. После того как в том же году иеромонах Пафнутий был назначен настоятелем малоярославецкого во имя святителя Николая Чудотворца монастыря, несколько насельников уехали с ним. 8 сентября 1864 г. Исаакий был возведён в сан игумена, 6 апреля 1885 г. – в сан архимандрита. Он был настоятелем Оптиной пустыни в течение 32 лет, что воспринималось современниками как редкое постоянство. В 1877 г. Московский митрополит Иннокентий (Вениаминов) выбрал Исаакия на должность наместника Троице-Сергиевой лавры, но он через влиятельных знакомых смог избежать этого назначения. Предшественник Исаакия Моисей (Путилов) расходовал значительные средства на монастырское строительство, и после его кончины наличных денег в монастыре практически не было, кроме того, оставался долг около 10 тыс. руб. Впоследствии Исаакий вспоминал: «Я принял обитель с одним гривенником». Долг вскоре был погашен при помощи благотворителей. За время его управления в Оптину пустынь поступало большое количество пожертвований, прежде всего, благодаря широкому почитанию старцев Амвросия и Илариона (Пономарёва), материальное положение обители укрепилось, хозяйство достигло процветающего состояния. Исаакий ограничил, а затем отменил практику направлять монахов за сбором пожертвований. Продолжал начатое до него строительство: в 1864 г. был достроен храм Всех святых на новом кладбище, в скитской церкви Иоанна Предтечи был устроен придел Макария Египетского в память тезоименитого оптинского старца (освящён 7 сентября 1864 г.), расширен Казанский собор со стороны паперти. В конце 1860 гг. был сооружён новый иконостас в Казанском соборе и перестроен старый во Введенском соборе, оба храма были вновь расписаны. По завещанию старца Илариона за южной стеной монастыря была построена больница с аптекой, а при ней – храм Илариона Великого (освящён 28 июля 1876 г.). Также были выстроены здания для книжной лавки, новой гостиницы, странноприимной, хлебной и др. Рухлядную, которая размещалась в корпусе с церковью праведной Анны и Марии Египетской, перевели в новое здание, была расширена мастерская по производству одежды и обуви. Одновременно в церкви праведной Анны и Марии Египетской устроили придел Амвросия Медиоланского и князя Александра Невского (освящён 1–2 декабря 1885 г.). В 1865 г. при монастыре открылся свечной завод, воск для которого доставлялся из Курска через родственников Исаакия. Настоятель поощрял разведение садов и огородов, приобрёл для Оптиной пустыни луговые земли, а также два лесных участка (в 500 и 200 десятин), что помогло решить проблему со строевым лесом и с топливом.