В 1639 и 1641 гг. униаты четыре раза обращались с жалобами в магистратский суд и в задворный королевский суд, который, в конце концов, признал притязания униатов законными, король Владислав IV обязал брестских мещан нести прежние повинности по отношению к Римскому костёлу и униатской церкви. Однако эти меры не привели к уменьшению православной паствы, многие горожане после кончины оставляли Симеоновской церкви свои земли и имущество. В 1680 г. Красинский, владелец земель, на которых располагался Брестский монастырь, построил при обители часовню во имя первомученика Стефана и оставил обители владение в городе. Красинский оговорил, что монастырь должен подчиняться православному Могилёвскому епископу, а в его отсутствие – Киево-Печерскому монастырю. Первый из известных игуменов Брестского монастыря – преподобномученик Афанасий (Филиппович) – управлял обителью с 1640 г. Выступая против унии, он стремился восстановить права брестского православного братства, объединявшего Брестский монастырь и монастырь Рождества Богородицы, и юридически оформить права последнего на владение землями и имуществом. После гибели игумена Афанасия в мае 1649 г. монахи Брестского монастыря обрели останки мученика и похоронили в храме Симеона Столпника, в склепе у правого клироса; в обители началось почитание святого. Игумен Брестского монастыря Иаков (Карасинский) в качестве представителя Луцкого епископа Гедеона (Святополка-Четвертинского) в августе 1681 г. участвовал в съезде депутатов духовенства и ставропигиальных православных братств в Новом Дворе; депутаты подписали «Постановление о мерах для защиты Православия», в котором подтвердили своё желание держаться православной веры и подчиняться Константинопольскому патриарху. В 1682 г. монастырь вёл тяжбу с напавшими на его владения иезуитами; насельникам Брестского монастыря удалось добиться от короля письма к иезуитам с призывом решать споры через суд. В контексте противостояния униатам исследователи рассматривают пожар в Брестском монастыре в 1716 г. 25 мая 1716 г. в брестский суд была внесена «манифестация», в которой ответственность за пожар возлагалась на противников православия (об этом пожаре говорится также в жалобе насельников Дятловицкого монастыря близ Пинска от 24 февраля 1722 г. Петру I на бедственное положение церкви в Речи Посполитой: «Монастырь преподобного отца Симеона Столпника з церквию новою и со всеми будованиями монастырскими сожгоша иновернии»).