За незаконное обращение к светскому суду Ипатий Потей приговорил Самуила к лишению сана и отлучению от церкви. Троицкий архимандрит подал виленскому православному братству просьбу принять его в число братчиков. На собрании 30 ноября 1608 г. виленские православные священники вместе с членами братства решили вернуть архимандриту Самуилу (Сенчило) настоятельство в Виленском монастыре после отречения от повиновения униатскому митрополиту. Последующие полгода были отмечены стихийными стычками между православными и униатами, взаимными исками, направленными в суды разных инстанций. В июле 1609 г. в Вильно состоялось выездное заседание суда при королевском дворе, решением которого виленские православные братчики были оштрафованы на 10 тыс. злотых, а архимандриту Самуилу предписывалось покинуть пределы Речи Посполитой. В августе 1609 г. Виленский монастырь окончательно перешёл под власть униатов. В ведение настоятеля монастыря светские власти передали все виленские приходские православные церкви. Униатский наместник обители Вельямин Рутский, а затем и его преемник архимандрит Иосафат Кунцевич преобразовали монастырь по образцу латинских монашеских орденов. Городской магистрат, состоявший теперь только из католиков и униатов, вынес постановление, в соответствии с которым каждый желающий вступить в купеческое братство или ремесленный цех должен был исповедаться в Троицком храме и принести оттуда удостоверение о принадлежности к унии; инициатор этого решения (Иосафат Кунцевич) бдительно следил за его исполнением. Таким образом, православные лишались средств к существованию, поскольку в соответствии с магдебургским правом после удаления ремесленника из цеха его профессиональная деятельность становилась невозможной. После ухода в 1611 г. из Виленского монастыря Вельямина Рутского его место занял бывший Патриарх Московский и всея Руси Игнатий (ум. около 1640 г.), который в 1612 г. вместе с поляками бежал из Москвы, осаждённой войсками князя Дмитрия Пожарского и Кузьмы Минина. В Речи Посполитой он перешёл в униатство. При нём в 1613 г. к Виленскому монастырю был присоединён ставший также униатским минский в честь Вознесения Господня мужской монастырь, который в 1635 г. был объединён с минским в честь Сошествия Святого Духа на апостолов мужским монастырём. В 1617 г. троицкие монахи вызвали на публичный диспут православных насельников Свято-Духова монастыря, однако те отказались, не надеясь на беспристрастность судей. Материалы несостоявшегося диспута с изложением униатской позиции опубликовал в том же году троицкий архимандрит Лев Кревза в сочинении «Оборона церковной унии». Особенно активно полемика между православным Свято-Духовым и униатским Троицким монастырями разгорелась в связи с литературной деятельностью Мелетия (Смотрицкого), который в те годы отстаивал православие. В 1620 г. Виленское православное братство издало в защиту восстановленной западнорусской православной иерархии трактат Мелетия «Оправдание невинности». В ответ троицкие монахи выпустили книгу «Сугубая вина» (1621 г.), сочинённую будто бы митрополитом Вельямином Рутским, в которой называли православных архиереев преступниками, нарушившими государственные законы.