В ходе полемики Виленский монастырь опубликовал направленные против «схизматиков» (православных) сочинения «Послание законникам виленского монастыря церкви Святого Духа», «Экзамен обороны» (оба: 1621 г.), содержавшие упрёки и брань в адрес Свято-Духовского братства и Мелетия (Смотрицкого), а также сочинение Антония Селявы «Antelenchus» (1622 г.). Помимо письменных оскорблений православные братчики подвергались частым физическим нападениям со стороны троицких монахов-униатов, студентов униатской семинарии. В 1617 г., когда был утверждён униатский василианский орден, униатское монашество освободилось от власти епархиальных архиереев и составило единую корпорацию, во главе которой стоял протоархимандрит. К середине XVII в. Виленский монастырь стал центром ордена василиан, обитель направляла братию в другие монастыри, одновременно сохраняя за собой освободившиеся штатные должности. В насельниках монастыря числилось более 100 человек. Из настоятелей и монахов Виленского монастыря ставились униатские епископы: Вельямин Рутский в 1613 г. занял митрополичью кафедру; Иосафат Кунцевич в 1618 г. был поставлен на Полоцкую архиепископию (после убийства Кунцевича Полоцкую кафедру в 1624 г. занял Антоний Селява, также бывший настоятель Виленского монастыря, с 1641 г. он являлся Киевским митрополитом); в 1625 г. из настоятелей Виленского монастыря на Смоленскую кафедру был поставлен Лев Кревза и т.д. Монастырь владел крупной недвижимостью и землями, полученными в качестве пожертвований от дворян и купцов. Среди жертвователей был и Вельямин Рутский, отписавший монастырю родовое имение в Новогрудском воеводстве. При Виленском монастыре существовал женский монастырь, к которому в 1609 г. был приписан Брацлавский монастырь. В XVII–XVIII вв. в Виленском монастыре были возведены каменные колокольня и святые врата. К Троицкому храму пристроены три часовни: в честь Воздвижения Креста Господня, Благовещения Богородицы и во имя апостола Луки. После пожаров 1706, 1748, 1749 гг. монастырь в 1760 г. был восстановлен по проекту архитектора Иоганна Критофа Глаубица: к келейному корпусу был пристроен 3-этажный флигель, капитально реконструирована Троицкая церковь. К середине XIX в. храм по своему внешнему виду и внутреннему убранству напоминал католический костёл с главным престолом и шестью алтарями, перед престолом находился переносной иконостас. В результате третьего раздела Польши (1795 г.) Вильна стала губернским городом Российской империи. После ревизии, проведённой в 1836 г., власти предполагали закрыть Виленский монастырь, однако епископ Иосиф (Семашко) 18 февраля 1837 г. подал записку в Министерство внутренних дел России, в которой писал, что «виленский базилианский монастырь мог бы быть впоследствии орудием восстановления здесь древнего Православия». После учреждения Виленской и Литовской епархии в 1839 г. Виленский монастырь был возобновлён как православный, в 1842 г. возведён в первый класс, в 1845 г. причислен к третьему классу с настоятелем-архимандритом, пятью иеромонахами, двумя иеродиаконами, одним монахом и четырьмя послушниками по штату. Первым настоятелем возобновлённой обители стал архимандрит Евсевий (Ильинский), впоследствии архиепископ Тверской.