27 мая 1584 г. король Стефан Баторий (1575–1586 гг.) предоставил право владения Виленским монастырём после кончины митрополита Онисифора православным членам виленской городской рады (совета), что позволило создать при монастыре Виленское православное братство, которое на свои средства содержало священника, диакона и иноков монастыря; братству принадлежал Сретенский придел Троицкого храма. В 1589 г., оставляя митрополичью кафедру, митрополит Онисифор напомнил о своём владении Виленским монастырём, но в 1590 г. отказался от этого права. В 1592 г. король окончательно передал Виленский монастырь представителям виленской рады. После заключения Брестской унии 1596 г. большинство архиереев Киевской митрополии стали униатами. В январе 1597 г. наместник Виленского монастыря архимандрит Софроний, поначалу принявший унию, отказался молиться за униатского митрополита Михаила (Рогозу), сдал ключи от монастырских построек и покинул обитель, но вскоре вернулся в униатство. После смерти Михаила (Рогозы) в сентябре 1599 г. в Виленском монастыре по благословению настоятеля архимандрита Иоасафа проповедовал один из главных противников унии – Стефан Зизаний. Его проповеди стали причиной закрытия Троицкого храма по указу униатского митрополита Ипатия Потея от 24 сентября 1599 г. Православные братчики переселились из Виленского монастыря к храму в честь Сошествия Святого Духа, где к 1605 г. устроился новый монастырь. В 1601 г. Ипатий Потей открыл в Виленском монастыре униатский митрополичий коллегиум, или семинарию, сразу же получившую земельные владения. Первый ректор семинарии (П.Ф. Сурометников) издал направленную против православных книгу «Оборона Собору Флорентийского осмаго» (не сохранилась). Насельники униатского монастыря активно писали и издавали полемические брошюры, направленные против православных: «Уния», «Разговор брестского мещанина с виленским братчиком», «Воскресший Наливайко», «Политика, называемая невежеством» и т.п. (не сохранились, известны по названиям), в которых, в частности, называли своих противников бунтовщиками против королевской власти. 16 ноября 1605 г. король Сигизмунд III Ваза (1587–1632 гг.) предоставил Виленский монастырь в пожизненное управление униату архимандриту Самуилу (Сенчило) с «удалением от заведования» обителью представителей виленской рады. В январе 1608 г. при монастыре было создано униатское братство, которому, по мнению Ипатия Потея, должны были перейти грамоты и привилегии, дарованные православному братству, и, таким образом, оно должно было прекратить своё существование (такого рода иски к православным братчикам выдвигались униатским братством до официального признания королём Владиславом IV Вазой (1632–1648 гг.) православного братства в 1632 г.). После того как Ипатий Потей в июле 1608 г. назначил своим наместником в Вильно насельника Виленского монастыря иеромонаха Иосифа Вельямина Рутского, известного своим стремлением к окатоличиванию униатов, архимандрит Самуил выступил против митрополита и в августе 1608 г. вместе с виленскими приходскими священниками обратился к собранию бурмистров и радцев русской общины с жалобой на действия митрополита.