Осенью 1934 г. Киевский Выдубицкий монастырь был занят военными частями. Были разрушены надгробия, и сбиты с них кресты, однако утверждение, будто в это время были разрублены и сожжены иконостасы всех выдубицких храмов, исследователи считают ошибочным: описание монастырского имущества от 28 мая 1936 г. свидетельствует о сохранении обоих иконостасов (Михайловского и Благовещенского) в старинном соборе. Иконостасы, облачения и сосуды священник К. Стешенко с членами общины официально передал Дарницкой общине во главе со священником В. Лысаковским. В 1924 г. все иконы из трапезной церкви были перенесены в Георгиевский собор. Во время фашистской оккупации специальная комиссия Киевской городской управы в акте от 31 мая 1943 г. указала, будто иконостас Георгиевского собора «уничтожен большевиками в 1930 г.». Исследователи считают это сомнительным, если учесть существование общины, её опеку над святынями обители и большое количество икон в соборе в 1936 г. С 1937 г. почти все строения Киевского Выдубицкого монастыря находились в ведении Ботанического сада и деревообрабатывающего комбината; здесь проживали рабочие и действовали продуктовые магазины. В 1939 г. в СНК УССР возник проект создания на базе Софийского собора музейного комплекса, в состав которого должны были войти и памятники монастыря. Соответствующее постановление было издано 7 марта 1939 г., но не воплощено в жизнь. Во время оккупации города 1941–1943 гг. Киевская городская управа издала постановление о возрождении монастыря или приходского храма в ведении УАПЦ. Однако исследователям не известно, было ли оно исполнено. В начале мая 1943 г. отмечено наличие в обители «архимандрита монастыря, ведающего всеми церквями». При этом Георгиевский собор был завален сеном и древесиной, которую здесь же рубили на дрова. Отмечалось сохранение росписей и пригодность собора к богослужениям. После освобождения Киева советскими войсками спецорганы засвидетельствовали проживание в обители в 1944 г. монахини и трёх монахов «патриаршей ориентации», в том числе настоятеля архимандрита Варлаама (Цывенко). Они были выселены, и монастырь вновь официально закрыли. Однако, как полагают исследователи, архимандрит Варлаам проживал в колокольне, по крайней мере, до 1955 г. Постановлением СНК УССР от 30 мая 1944 г. Киевский Выдубицкий монастырь был присоединён к заповеднику «Киево-Печерская лавра», но 21 ноября 1944 г. передан на баланс Ботанического сада Академии Наук УССР, администрация которого сдала в аренду все строения монастыря Киевпромторгу, издательству Академии Наук УССР, Центральной научной библиотеке Академии Наук УССР. В 1967–1982 гг. в монастырском комплексе были проведены масштабные реставрационные работы под руководством Р.П. Быковой. В 1975–1997 гг. на территории и в зданиях монастыря размещался Институт археологии. В 1992 г. Киевский Выдубицкий монастырь был частично (до окончательного выселения Института археологии в 1997 г.) передан Украинской православной церкви (УПЦ). В 2013 г. постройки занимала мужская община раскольнического «Киевского Патриархата УПЦ».