В Послании великому князю Василию III он отметил, что «в писании... того нет, кое еретиков по манастырем посылать: на всех... соборех по проклятии еретиков посылали в заточение, да сажали по темницам, а не в манастыри посылали их». По решению Собора 1525 г. Иосифов Волоколамский монастырь стал местом заточения Максима Грека, который в 1525–1531 гг. содержался в помещении Германовой башни. Во исполнение решения церковного суда заключённый был лишён права общаться с окружающими и излагать свои взгляды письменно. В двух рукописях из библиотеки монастыря (Российская государственная библиотека) сохранились тексты, которые учёный грек нацарапал каламом. Осуждённый на церковном Соборе 1531 г. Вассиан (Патрикеев) был сослан в Иосифов Волоколамский монастырь. Согласно тенденциозному известию князя Андрея Михайловича Курбского, смерть Вассиана возлагалась на иосифлян («Российская историческая библиотека», том 31). На Соборе в феврале 1549 г., который осудил Исаака Собаку, свидетелем обвинения был архимандрит Нифонт (Кормилицын). В 1553 г. по поручению царя и Московского митрополита Макария «розыск» о ереси М.С. Башкина и др. проводили старцы Иосифова Волоколамского монастыря монах Герасим (Ленков) и Филофей (Полев; Полное собрание русских летописей). М.С. Башкин был осуждён на заточение в Иосифовом Волоколамском монастыре. По предположению А.А. Зимина, в годы опричнины в Иосифовом Волоколамском монастыре были насильно пострижены в монахи соратник Сильвестра протопоп Симеон и боярин князь Дмитрий Немой. «В смирении» в монастыре при игумене Иоасафе (1590–1592 гг.) находился «первый грешник перед Богом» Васюк Курицын (Российская государственная библиотека). На протяжении XVI в. по-разному решался вопрос о подсудности братии Иосифова Волоколамского монастыря. Так, в грамоте великого князя Василия III Ивановича 1522 г. (Акты феодального землевладения и хозяйства), как и в грамотах великого князя Ивана IV Васильевича 1534 г. (Акты феодального землевладения и хозяйства), говорилось о подсудности игумена и братии великому князю или его дворецкому. Действие таких грамот было аннулировано решениями Стоглавого Собора (1551 г.), но при этом, по мнению исследователей, подчинение игумена и братии Новгородскому архиепископу не произошло. Так, в грамоте 1556 г. царя Ивана IV Васильевича указывалось, что игумена и братию судит Московский митрополит Макарий «по новому соборному уложению» (Акты феодального землевладения и хозяйства). В 1558–1559 гг. митрополит Макарий разбирал жалобы на старца монастыря Тихона (Хворостинина). Лишь в декабре 1563 г. была установлена подсудность братии Новгородскому архиепископу (Акты феодального землевладения и хозяйства). В 1578 г. царь Иван IV подчинил братию монастыря своему суду (Акты феодального землевладения и хозяйства), но исследователям неизвестно, сохранялось ли это правило при его преемниках.