Среди главных сокровищ собрания – сборник гомилий Василия Великого, пасхальная литургия Григория Богослова, хроника Джованни Виллани с 225 миниатюрами, несколько рукописей гуманистов. С 1971 г. для читателей открыт журнальный зал, располагающий более чем 1000 научных периодических изданий на различных языках. Ватиканская библиотека использует правила каталогизации и схему классификации Библиотеки Конгресса США. Имеет два основных отдела: Ватиканский фонд и Палатинскую библиотеку. С 1952 г. начато фотокопирование рукописей, с 1964 г. – репродуцирование редких печатных книг. С 1985 г. создаётся электронный каталог Ватиканской библиотеки. В 1997 г. был составлен и включён в международную базу данных ISTC полный каталог ватиканской коллекции инкунабул, насчитывающей 8300 томов. С 1934 г. при Ватиканской библиотеке действует школа библиотечного дела. Библиотека ведёт широкую издательскую деятельность, организовываются выставки, в числе которых юбилейная выставка, посвящённая 500-летию основания Ватиканской библиотеки (Рим, 1975 г.), «Славянские рукописи и документы по истории Болгарии в Ватиканской апостолической библиотеке» (София-Рим, 1978–1979 гг.), «Византийские кодексы нестоличного происхождения в Ватиканской апостолической библиотеке» (Рим, 1988 г.), «Ренессансные литургические кодексы в Ватиканской апостолической библиотеке» (Рим, 1995 г.) и др. Славянский фонд состоит не менее чем из 101 кодекса, их отрывков и грамот XI–XX вв., написанных глаголицей, кириллицей и латиницей (чешские и часть хорватских), что составляет около половины от общего числа славянских рукописей в хранилищах Италии. Отдельные славянские рукописи, такие как лицевая Хроника Константина Манасси и, как полагают исследователи, «Служебник митрополита Исидора», находятся в библиотеке со второй половины XV в. Начало формирования отдельного фонда (первоначально самостоятельных Vaticani slavi и Vaticani illirici) относится к 1686 г. В настоящее время основное число славянских памятников собрания входит в состав фондов Vaticani slavi (70 единиц хранения) и Borgiani illirici (17 единиц хранения). Последний представляет, в основном, собрание кардинала Стефана Борджа (ум. в 1804 г.), поступившее в Ватиканскую библиотеку в 1902 г. вместе с коллекцией Коллегиума Конгрегации по распространению веры; отдельные славянские рукописи находятся в составе неславянских фондов. Фонд Vaticani slavi продолжает пополняться за счёт отдельных приобретений и дарений. При относительно небольших размерах фонда среди славянских рукописей Ватиканской библиотеки есть ряд важных в научном отношении памятников. Здесь находятся две из древнейших рукописей, входящие в старославянский канон, – глаголическое Ассеманиево Евангелие и кириллический Ватиканский палимпсест. Для истории болгарской средневековой книжно-письменной традиции большое значение имеют Барберинский славянский палимпсест, лицевая Хроника Манасси, написанная для царя Иоанна Александра, богослужебный сборник последней трети XIV в. Ватиканский список Хроники Манасси, украшенный 69 миниатюрами, также является ценнейшим памятником болгарского изобразительного искусства середины XIV в.