В год основания библиотека насчитывала 2527 кодексов, а в более позднем каталоге Платины (1481 г.) их было уже около 3500. В тот период книги выдавались читателям и на руки. Папа Юлий II (1503–1513 гг.) передал Ватиканской библиотеке дополнительные помещения, а в конце XVI в. папа Сикст V (1585–1590 гг.) поручил архитектору Доменико Фонта́не строительство нового здания. Просторный богато декорированный читальный зал на верхнем этаже получил известность как Сикстинский зал (Salone Sistino). Тогда же была учреждена Ватиканская типография (1587 г.). В XVI в. увеличение влияния Ватиканской библиотеки отразилось и на структуре управления: папа Павел III (1534–1549 гг.) учредил сан кардинала-библиотекаря Римской церкви. Библиотека располагала собственным штатом специалистов книжного дела (корректоры и скрипторы, реставраторы, переплётчики и др.). В 1585 г. кардиналом-библиотекарем стал Антонио Карафа (1538–1591 гг.), богослов и знаток греческого языка, активный деятель Тридентского собора. Работавшая под его руководством комиссия по исправлению текста Вульгаты широко использовала фонды Ватиканской библиотеки. В 1591 г. значительная часть библиотеки Антонио Карафы влилась в фонды Ватиканской библиотеки (более 150 латинских и греческих манускриптов), чуть позднее – в собрание кардинала Фульвио Орсини (413 манускриптов, в том числе более 100 греческих). Папа Павел V (1605–1621 гг.) приобрёл для Ватиканской библиотеки 28 рукописей из монастыря св. Колумбана в Боббио. В начале XVII в. братья Ранальди начали создание нового каталога латинских манускриптов (1620 г.), классифицировали греческие рукописи, под которые был отведён специальный зал (так называемый Bibliotheca graeca). В 1623 г. герцог Максимилиан Баварский после взятия в ходе Тридцатилетней войны города Гейдельберга передал папе Григорию XV (1621–1623 гг.) военный трофей – Палатинскую библиотеку, собранную курфюрстами Пфальца. Она вошла в Ватиканскую библиотеку отдельным фондом (Fondo Palatino – более 3500 рукописей, в том числе 1956 латинских и 432 греческих), как и все последующие крупные приобретения. В 1657 г. папа Александр VII (1655–1667 гг.) выкупил у наследников богатейшее книжное собрание урбинского герцога Федериго да Монтефельтро (Fondo Urbinate – 1767 латинских и итальянских, 165 греческих и 128 восточных рукописей). В 1689 г. папа Александр VIII (1689–1691 гг.) выкупил коллекцию шведской королевы Кристины, собранную ею большей частью в годы жизни во Франции (Fondo Reginense – 2120 латинских и 190 греческих кодексов). В 1746 г. в Ватиканскую библиотеку по завещанию перешла коллекция римского библиофила и археолога маркиза Алессандро Каппони (Fondo Capponiano, 288 кодексов). В 1748 г. фонды библиотеки пополнились собранием Оттобони, в основе которой была коллекция папы Александра VIII (Fondo Ottoboniano – 3394 латинских и 473 греческие рукописи; некоторые греческие кодексы этого собрания происходили из монастырей Афона). В 1804 г. в состав Ватиканской библиотеки было включено собрание кардинала Стефано Борджа. В период руководства католической Конгрегацией по распространению веры он собрал уникальную коллекцию рукописей (в Fondo Borgiano помимо 768 латинских входят 276 арабских, 178 сирийских, 136 коптских, 88 армянских рукописей, а также кодексы на других редких языках, в том числе один манускрипт XVI в. из доколумбовой Мексики).