Первым священником при утверждении общежития в 1841 г. стал Михей Павлович Богрецев, в 1857 г. – 70-летний священник Кирилл Стефанович Успенский. Из причта, служившего в храмах монастыря в 1880–1890 гг., исследователям известны священник Пётр Петрович Соловьёв и дьякон М. Соколов. С 25 августа 1906 г. служил Михаил Виноградов. В июле 1910 г. упоминается второй священник Николай Васильевич Скворцов, с 1915 г. служил священник Димитрий Ильич Розанов. Насельницы пользовались духовными советами Филарета (Дроздова), преподобных Антония (Медведева), Антония (Путилова). В 1841 г. в обители проживали 34 сестры, в 1877–1883 гг. – до 160 человек, в 1894 гг. – около 200, в 1899 г. – 252, в 1904 г. – 275 человек, в 1908 г. – 30 монахинь и 246 остальных насельниц, в 1913 г. – 277, в 1914 г. – 250 насельниц. В 1900 г. из положенных по штату (кроме игуменьи и казначеи) 39 монахинь и 39 рясофорных послушниц в Зосимовой пустыни проживали 27 монахинь, 36 рясофорных послушниц, в 1914 г. – 38 монахинь и 37 рясофорных послушниц. Со времени основания до 1841 г. сёстры жили по общежительному уставу, составленному Зосимой в соответствии с наставлениями Василия Великого: «Ни одна ничего собственного не имеет, но у всех общее и все в совершенном нестяжании. Ни от кого никаких подарков, ниже от родных, не приемлют, но всё отдают на общее содержание». Практиковалось суровое ограничение в пище: «В постные дни трапеза однажды в день в третьем часу пополудни. Млечные снеди во весь год не едят, токмо на всеедных неделях». Введено правило для начальницы не выделять свой стол от стола сестёр: «Сама начальница с посещающими гостями не ест, ниже пьёт некое усладительное одна без сестёр, якобы для угощения, хотя бы и от самих гостей было нечто такое принесено». При утверждении общежития в 1841 г. в обители был введён устав, написанный Московским митрополитом Филаретом. Престольные праздники отмечались в дни Святой Троицы, Смоленской иконы Божьей Матери «Одигитрия» (28 июля), Рождества Иоанна Предтечи (24 июня), Симеона, епископа Персидского, и Зосимы Соловецкого (17 апреля), Марии Египетской (1 апреля). Почитались также дни памяти и кончины основателя монастыря Зосимы (17 апреля, 24 октября), первой игуменьи Веры (Верховской; 17 сентября, 20 ноября), схимонахини Маргариты (Верховской; 1 сентября, 27 июля). В день памяти старца Зосимы 24 октября все сёстры причащались Святых Таин. Два раза в год в храмовые праздники вокруг монастыря совершался крестный ход. По отзыву, составленному благочинным в 1878 г., «в трапезе есть та особенность, что поминают благотворителей обители, молятся о здравии живых и о упокоении умерших, чего нигде не введено; это заповедано самим старцем Зосимою, и в точности исполняется более полувека». Собор во имя Святой Троицы возведён по благословению митрополита Филарета над гробом Зосимы. Перед смертью старец завещал сёстрам «первый престол» посвятить Святой Троице, второй – Смоленской иконе Божьей Матери «Одигитрия». По благословению митрополита Филарета прошение на строительство было подано от лица грузинской царевны Тамары, почитавшей старца и согласившейся «быть орудием устроения» первого храма в Зосимовой пустыни. Указом Синода от 4 ноября 1837 г. разрешалось возведение храма «для слушания грузинской царевне Тамаре, по слабости её здоровья, литургии».