Это положение сохранялось и во второй половине XV в.: действовал запрет на строительство новых православных храмов, права православного населения были ущемлены (православной знати в Великом княжестве Литовском не дозволялось занимать высшие государственные должности, православные мещане в городах Галичины не допускались в состав городских магистратов, не принимались в цехи, православные крестьяне должны были платить десятину на содержание католических священников и др.). Несмотря на то что в первой половине XVI в. в Великом княжестве Литовском ограничения, направленные против православных, уже не действовали (этому способствовало желание власти обеспечить их лояльность в борьбе с Русским государством), относительно благоприятная ситуация не была надлежащим образом использована, чтобы усилить позиции Западнорусской митрополии и укрепить её внутреннее положение. В середине XVI в. в Польско-Литовском государстве широко распространилась Реформация, что привело к переходу в протестантизм многих православных магнатов и дворян. Начиная с 1570 гг. и особенно в первой половине XVII в. в результате активизировавшейся в ходе Контрреформации прозелитской деятельности католической церкви, главную роль в которой играл орден иезуитов, стал массовым переход западнорусской православной шляхты и городского мещанства в католицизм. Сменив веру, феодалы присваивали себе имущество находившихся под их опекой церковных учреждений. В результате этого перестали существовать многие древние православные обители, епископские кафедры и монастыри Западнорусской митрополии лишились части владений. Активные попытки укрепить позиции православия в Польско-Литовском государстве, прежде всего, в Вильно и во Львове, делались объединениями православных мещан (братствами) и православными магнатами, в частности, князьями Константином Константиновичем Острожским и Андреем Михайловичем Курбским. При участии русских первопечатников Ивана Фёдорова и Петра Мстиславца появились первые православные издания, в конце 1570 – 1580 гг. стали создаваться училища для православной молодёжи (Острожская школа, Львовское и Виленское училища), были написаны полемические произведения, направленные против католиков и протестантов. В последние десятилетия XVI в. все эти начинания нашли поддержку у восточных патриархов – Константинопольского Иеремии II (1572–1579, 1580–1584, 1587–1595 гг.) и Александрийского Мелетия I Пигаса (1590–1601 гг.). Неоднозначными были действия западнорусских архиереев по отстаиванию интересов православной церкви. Рубеж XV и XVI вв. отмечен рядом попыток епископов Западнорусской митрополии укрепить дисциплину и ограничить власть светских патронов над церковными учреждениями. Особо важное значение в данной связи имели решения Собора, созванного в Вильно в декабре 1509 г. митрополитом Иосифом (Солтаном). Одновременно, желая получить равные права с католическими иерархами, некоторые архиереи стремились к заключению унии с Римом, эту инициативу поддерживала государственная власть.