Сложность монашеской жизни в непосредственной близи от многолюдной верфи и материальные трудности привели к упразднению воронежского монастыря, который в 1700 г. указом Петра I вместе с вотчинами был переведён в Акатов монастырь, Успенский храм обращён в приходской при адмиралтействе. В 1700–1711 гг. в нём проходили торжественные церемонии при спуске на воду судов. На богослужениях, которые совершали Воронежские епископы, часто бывал Пётр I (по преданию, пел на клиросе). До начала XX в. в храме хранился стул с высокой спинкой, обитый чёрным сафьяном, по преданию сделанный Петром I. После неудачного Прутского похода 1711 г. строительство кораблей в Воронеже прекратилось. Пожар 9–10 мая 1748 г. истребил район бывшей верфи, жители которого переселились на мысы, в степь и на верхнее городское плато. Успенская церковь стала беднейшей среди воронежских храмов, в последней четверти XVIII в. в храме служил один священник. В начале XIX в. Успенский храм стал благоустраиваться, в 1803 г. была сооружена трёхъярусная колокольня, правый придел (в честь иконы Божьей Матери «Всех скорбящих Радость») был переосвящён в честь Богоявления, в 1823 г. освящён левый придел во имя святителя Алексия Московского, в 1859 г. переосвящённый во имя преподобных Антония и Феодосия Печерских. В 1873 г. был построен дом для причта. После ремонта в 1880–1881 гг. храм был заново расписан. В 1805 г. в Успенской церкви служили протоиерей, диакон, дьячок и пономарь, в 1885 г. – священник, диакон и псаломщик. С 1893 г. при храме действовало церковноприходское попечительство, располагавшее капиталом в 1513 руб., проценты с которого выдавались бедным прихожанам к Рождеству Христову и на Пасху. В 1894 г. на средства Екатерины Васильевны (?) Гардениной при церкви была построена богадельня (на 12 человек), с 1895 г. половину здания занимала школа (на 20 девочек). В 1932 г., после закрытия воронежского Троицкого Смоленского собора, Воронежский архиепископ Захария (Лобов) перенёс кафедру в Успенскую церковь. Часть клириков храма уклонились в обновленчество (Заместитель Патриаршего Местоблюстителя митрополит Сергий (Страгородский) объявил штат Успенской церкви состоящим в расколе). По доносу клириков, уклонившихся в раскол, были арестованы архиепископы Захария и Пётр (Соколов). В феврале 1940 г. Успенский храм был закрыт и передан горсоветом Осоавиахиму. Во время Отечественной войны сгорела кровля трапезной и несколько куполов храма, в стенах образовались трещины. Летом 1946 г. храм передали Государственному архиву Воронежской области, в конце 1940 гг. во время ремонта были уничтожены росписи. В 1969 г. Успенская церковь перешла в ведение краеведческого музея, приобрела статус памятника архитектуры республиканского (позже федерального) значения. Перед празднованием 1000-летия Крещения Руси в 1988 г. и 300-летия Военно-морского флота была устроена гидроизоляция храма (после 1972 г. в результате затопления чаши Воронежского водохранилища храм оказался в болотистой местности). В сентябре 1996 г. Успенская церковь была передана Воронежской епархии, стала приписной к Никольской церкви, в августе 2001 г. приобрела самостоятельный статус. В ноябре 1998 г. Успенский храм посетил Патриарх Московский и всея Руси Алексий II. 8 мая 2002 г. по благословению Воронежского митрополита Мефодия (Немцова) в церкви была установлена мемориальная доска в память о воронежских моряках, погибших на подводных лодках «Комсомолец» и «Курск» (автор – скульптор А.И. Кожевников). 12 июня 2002 г. на острове у храма был воздвигнут деревянный крест в память 330-летия рождения императора Петра I. В следующем году в храм передали флаг атомной подводной лодки «Воронеж».