До 1608 г. здесь преподавал латынь и греческий Логгин Карпович, трудившийся также в братской типографии в качестве печатника и корректора, с 1614 г. – архимандрит Свято-Духова монастыря. С начала своего существования школа Виленского братства терпела нападки со стороны виленской иезуитской академии, в 1598 г. студенты академии учинили разгром братской школы. В типографии Виленского братства в 1590 гг. были напечатаны «Грамматика словенска съвершеннаго искуства осми частий слова и иных нуждных» Лаврентия Зизания (1596 г.), «Казанье святого Кирилла, патриарха Иерусалимского, о антихристе и знакох его, з росширением науки против ересей розных» Стефана Зизания (1596 г.), составленная Зизаниями «Наука ку читаню и розуменю писма словенского, тутыж о Святой Троици и о Вочеловечении Господни» (1596 г.), а также «Книга о вере» (1596 г.), «Молитвы повседневные» (1595, 1596 гг.), Псалтирь (второе издание в 1595, 1596 гг.), Часовник (1596 г.), Часовник с Букварём (1596 г.), Новый Завет с Псалтирью (около 1596 г.). Виленское братство активно участвовало в Брестских соборах Западнорусской митрополии (1590–1594 гг.), на которых обсуждались возможные преобразования в церковной жизни для упрочения положения православной церкви. На Соборе 1594 г. Виленское братство и православное дворянство Великого княжества Литовского предложили использовать доходы епископских кафедр на содержание школ, строительство храмов и больниц (предложение братства Собором не было принято). После заключения Брестской унии 1596 г. большинство архиереев Киевской митрополии перешли в униатство, униатскими стали многие приходские церкви. По распоряжению (24 сентября 1599 г.) принявшего унию митрополита Ипатия Потея в октябре 1599 г. был закрыт принадлежавший Виленскому братству придел Троицкого храма, непосредственной причиной запечатания придела стали антиуниатские проповеди Стефана Зизания. Ранее, в 1597 г., братчики построили недалеко от Троицкого храма деревянную церковь в честь Сошествия Святого Духа на апостолов. Около 1600 г. Свято-Духовский храм (с 1605 г. – монастырь) стал братским, братство с того времени именовалось Свято-Духовским. Другая часть братчиков во главе с новогрудским воеводой Фёдором Ивановичем Скумином-Тышкевичем приняла униатство и объявила не присоединившихся к унии членов братства узурпаторами королевских и патриарших грамот. Униатское Троицкое братство, утверждённое королём 20 января 1608 г., получило всё братское имущество и осталось в Троицком монастыре, который вскоре превратился в крупный центр униатской пропаганды. Монахи-униаты и студенты униатской семинарии, открывшейся в Троицком монастыре, неоднократно совершали нападения на насельников Свято-Духова монастыря, на учеников братской школы и православных братчиков. К августу 1609 г. все православные храмы Вильно (за исключением Свято-Духовского) перешли в унию. Противодействие распространению унии стало одним из главных направлений деятельности Виленского братства. В 1608 г. братство опубликовало написанное на польском языке анонимное сочинение «Ответ на едкое сочинение, напечатанное отступниками от Восточной Церкви против народа старой греческой веры», в котором опровергались две брошюры, изданные Ипатием Потеем против Виленского братства и вообще православных.